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試劑、試劑盒 溶液與緩沖液 BSA LoTE cDNA標簽 實驗步驟 實驗方案 A 1.向兩個含有釋放的 cDNA 標簽的試管中加入： 2.在 37°C 下孵育 30 min。 3.加入 150ul LoTE 擴容到 200ul。 4.如上所述，用等體積的 PCI 抽提，乙醇沉淀（實驗方案 A，第 2 步)。 5.將沉淀溶解于 4ul 的 LoTE 中。 實驗方案 B 1.向沉淀的 cDNA 標簽中加入： 2.在 37℃ 下孵育 30 min。 3.加入 170ul 的 LoTE 擴容到 2004。 4......閱讀全文
實驗材料 λ噬菌體臂 大腸桿菌菌株 用于λ噬菌體的包裝抽提物 試劑、試劑
此經典方案建立在 Gubler-Hoffman 法（Gulber-Hoffman 1983) 之上，分為六個階段。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶
劉光清 劉在新 謝慶閣(中國農業科學院蘭州獸醫研究所農業部畜禽病毒學重點開放實驗室,蘭州730046)摘 要: 反向遺傳技術是一種新興的分子生物學技術, 已廣泛應用于生命科學研究的各個領域。綜述反向遺傳技術研究進展,并討論該技術在口蹄疫病毒研究中的應用。關鍵詞: 反向遺傳學 反向遺傳技術 全長c
第一節 概 述 從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了解轉錄后加工
類似方案 1、方案 2 描述了在真核表達載體上進行 cDNA 文庫構建與篩選的方法, 流程分為以下兩個階段：1. 在真核表達載體上構建 cDNA 文庫；2. 在真核表達載體上構建的 cDNA 文庫的篩選。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料宿主細胞質粒或λ噬菌體表達載體
真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3’末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴增由微量的mRNA逆轉錄得到的cDNA文庫、如何利用已知片斷序列得到
真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3’末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴增由微量的mRNA逆轉錄得到的cDNA文庫、如何利用已知片斷序列得到全長的cDNA
實驗材料 宿主細胞 質粒或λ噬菌體表達載體 包裝提取物 電轉化感受態大腸桿菌
真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3'末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴增由微量的
實驗材料 宿主細胞質粒或λ噬菌體表達載體包裝提取物電轉化感受態大腸桿菌試劑、試劑盒 限制性內切核酸酶緩沖液限制性內切核酸酶通過 poly(A)+富集的 mRNAcDNA 文庫含適當抗生素的 Terrific 球脂平板含適當抗生素的 Terrific 肉湯培養基儀器、耗材 cDNA 合成試劑盒實驗步驟
cDNA文庫構建可以：（1）用于分離全長基因進而開展基因功能研究；（2）篩選目的基因并直接用于表達；（3）提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。實驗方法原理cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建
一、RNA 制備 模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結構特點,容易受RNA 酶的攻擊反應而降解,加上RNA 酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人
cDNA文庫構建 實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉
方法cDNA 末端的削平1.cDNA樣品（來自步驟 11)于 68°C 加熱5 min。這一步驟是使cDNA分子的單鏈突出端可能形成的雙鏈結構發生變性。2. 將cDNA溶液冷卻至37°C并加入下列試劑：5xT4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 &n
cDNA文庫[原理]：cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA開始，在此基礎上，通過反轉錄酶作用產生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以第一條DNA鏈為模板復制
本方案使用克隆在 BAC 載體上的一段 500kb 的人基因組 DNA 連續序列，直接篩選與其互補的的 cDNA。但本方法也可適用于任意大小的基因組靶 DNA。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。試劑、試劑盒擴增緩沖液DNA 聚合酶 DNaseI限制性內切核酸酶ATP鏈霉親和素
摘 要： RACE是一種快速克隆cDNA末端的方法，目前, 該方法被廣泛應用于未知堿基序列基因的克隆，尤其是SMART RACE技術更為人們所青睞。本文總結了我們實驗室用SMART RACE技術克隆基因的一些心得體會，希望對用RACE方法克隆基因的同行有些幫助。關鍵詞： RACE; RN
差減克隆是分離和鑒定兩個細胞群中差異表達的 mRNA 的有效技術。相比較的細胞類型是［＋］（或 測 試）細胞和［-］（或驅動）細胞，在測試細胞中表達而不在驅動細胞中表達的 mRNA 將被分離出來。必需的差減次數主要取決于 cDNA 的多樣性。多樣性是指每一個細胞類型中不同的cDNA 或 cDNA 片
試劑、試劑盒 擴增緩沖液 DNA 聚合酶 DNaseI 限制性內切核酸酶 ATP 鏈霉親和素-磁珠結
實驗材料 λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒 放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶RNase 抑制劑用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸T4
試劑、試劑盒 擴增緩沖液DNA 聚合酶 DNaseI限制性內切核酸酶ATP鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液T4DNA 連接酶熱穩定 DNA 聚合酶瓊脂糖凝膠BACDNA缺口平移緩沖液雜交液平末端 cDNACot1 基因組 DNA胞漿 poly(A)+RNAdNTP 溶液DNA 分子質量標志物寡
分離高質量RNA成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol試劑法（見下圖）將一步法加以提高，可以從多種
真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟
實驗方法原理 實驗材料 A 和 B 類細胞的雙鏈 cDNA （ds cDNA）試劑、試劑盒 ALuIRsaIATPT4 多聚核苷酸激酶及其緩沖液DNA連接酶和及其緩沖液Taq DNA聚合酶及其緩沖液寡核苷酸引物4dNTP 混合物驅動 dNTP 混合物轉化感受態菌株HEPES緩沖液鏈霉親和素溶
實驗方法原理 實驗材料 A 和 B 類細胞的雙鏈 cDNA （ds cDNA）
1．RNA的提取 RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，zui后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。 1．1分離高質量RNA 成功的cDNA合成來
第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第一節概述 從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA 的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA 和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA 文庫,構建的cDNA 文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA 和相
從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題。總之
第一節 概 述 從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了
具體的實驗步驟cDNA第一條鏈的合成：我們建議進行cDNA合成的對照反應，這樣可以對樣品的 cDNA的合成進行鑒定。加入各種試劑之后，在氣浴中42度保溫一個小時。注意： 在水浴或酒精浴中保溫回減少反應體積，從而降低第一鏈的合成效率。將管放于冰上，以終止第一鏈的合成反應。直接進行第二鏈的合成。cDNA