從RNA的提取到PCR——RealtimePCR經驗
一 引物的設計引物的設計對于這個實驗至關重要，因為real time pcr的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規PCR，引物同源性不高，只要兩條產物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區分開就可以。real time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結果誤差很大，不可信）。3，引物設計要跨內含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。4，引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家......閱讀全文
PCR經驗總結（二）
5. touchdown PCR?? 原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度94 5min?? 94 30s?? 60 30s?? 72 1min 2cycles?? 94 30s?? 59 30s?? 72 1min 2cycles?? 94
REALTIME－PCR－WITH－SYBR－GREEN－I－PROTOCOL
1、反應體系 25ulCocktail 20 ul: Primer FP 1 ul + Primer RP 1u + 2 * SYBR GREEN I MIX 12.5 + H2O 5.5 ul cDNA 5 ul2、Primer 濃度，需要摸索，從200nM到700nm等，設置不同濃度。3、每個引
realtime－PCR－常用儀器和探針
?1.SYBR Green I：一種DNA結合染料，能非特異性地與雙鏈DNA結合，結合后發出熒光，價格便宜，但因無特異性，易受到非特異性擴增和引物二聚體地的影響，是定量結果不可靠。可用融解曲線分析區分特異性和非特異性擴增，引物的設計和反應條件的優化對消除非特異性熒光有很大幫助。2.Taqman探針：
realtime－PCR－常用儀器和探針
SYBR Green I：一種DNA結合染料，能非特異性地與雙鏈DNA結合，結合后發出熒光，價格便宜，但因無特異性，易受到非特異性擴增和引物二聚體地的影響，是定量結果不可靠。可用融解曲線分析區分特異性和非特異性擴增，引物的設計和反應條件的優化對消除非特異性熒光有很大幫助。 2.Taqman探針：
Realtime－PCR實驗注意事項
實驗中的一些好習慣加入試劑之前,把它混勻一下,以免放置時間長了濃度不均移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性一定要記著關水浴箱，切記切記多和大家討論，同時多關注別人討論的經驗，這幾乎是最快提高的捷徑了所有的試劑都自己配，出了問題才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器
Realtime－PCR實驗注意事項
Real-time PCR實驗注意事項實驗中的一些好習慣加入試劑之前,把它混勻一下,以免放置時間長了濃度不均移液槍用完之后要歸到zui大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性一定要記著關水浴箱，切記切記多和大家討論，同時多關注別人討論的經驗，這幾乎是zui快提高的捷徑了所有的試劑都自己配，出了問題才好
實時熒光定量PCR（Realtime－PCR，QPCR，熒光定量）分類以...
實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）分類以及實驗步驟介紹實時熒光定量PCR（Real-time?PCR，QPCR，熒光定量）技術（Real-time?quantitative?PCR），是指在（QPCR，熒光定量）反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號積累實時監測整個（
realtime－PCR技術的原理及應用
一、實時熒光定量PCR原理（一）定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法 。（二）實時原理1、常規PCR技術：對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。2、實時定量PC
Realtime－PCR－數據導出－——－ABI儀器篇
1. Real-time PCR數據：Real-time PCR完成后，所有數據并非可以直接導出，由于每一次實驗的情況都不相同，儀器的很多默認設定都會對最終數據結果造成重大偏差，所以在完成PCR過程后，需要人為對實驗結果進行條件設置，才能提取到科學有效的實驗結果，進而完成對實驗結果的分析和判斷。
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
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這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
RtPCR經驗總結
Rt-PCR實驗步驟一、實驗器具與材料：1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸頭：1ml、200μl、20μl3、勻漿管：5ml4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，
RNA抽提注意事項和經驗指南1
背景介紹實驗前方法/試劑的選擇問題解答 (外源性污染導致的問題不在本解答考慮中)RNA 抽提的“三大紀律八項注意”Rnase 污染的10大來源RNase 和 DEPC 處理RNA 抽提的10大竅門提高 RNA 得率經典抽提小技巧特殊組織的抽提樣品凍融的影響RNA 質量的判斷RNAguard：使降解成
RNA抽提－成功經驗法則大公開!
本期專文要來跟大家討論的話題是核糖核酸(RNA)的萃取，看到這里各位心中可能已經起了疑問: RNA 萃取不是很簡單嗎?只要照著標準步驟操作，加一加試劑就完成了，有必要大費周章特地開篇幅來談這件事嗎?其實越簡單的東西遇到困難時就越難解，各位看倌就請耐著性子，聽我們娓娓道來。 Lab 的經驗和
RNA抽提注意事項和經驗指南2
3：裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內源雜質殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點是要結合純化方法一起考慮。只有一個例外：高內源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內源酶的能力。 4：純化方法的選擇 – 影響內源雜質殘留。抽提速度的因素對于干凈的樣
RNA抽提注意事項和經驗指南3
RNA 抽提的“三大紀律八項注意” 紀律一：杜絕外源酶的污染。注意一：嚴格戴好口罩，手套。注意二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。注意三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。紀律二：阻止內源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。注意
RNA抽提注意事項和經驗指南1
背景介紹實驗前方法/試劑的選擇問題解答 (外源性污染導致的問題不在本解答考慮中)RNA 抽提的“三大紀律八項注意”Rnase 污染的10大來源RNase 和 DEPC 處理RNA 抽提的10大竅門提高 RNA 得率經典抽提小技巧特殊組織的抽提樣品凍融的影響RNA 質量的判斷RNAguard：使降解成