RtPCR經驗總結
Rt-PCR實驗步驟一、實驗器具與材料：1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸頭：1ml、200μl、20μl3、勻漿管：5ml4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、試管架：5ml、1.5ml、20μl10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水11、鋁制飯盒：4個12、塑料小飯盒：1個13、大瓷缸：2個14、錫泊紙：一卷15、卷紙：2卷16、三角燒瓶：帶蓋，稍大二、實驗器具的處理與準備1、塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，......閱讀全文
RtPCR經驗總結
Rt-PCR實驗步驟一、實驗器具與材料：1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸頭：1ml、200μl、20μl3、勻漿管：5ml4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，
定量RTPCR－（Quantitative－RTPCR）
Application:?Quantitative RT-PCR?is used to quantify mRNA in both relative and absolute terms. It can be applied for the quantification of mRNA expres
PCR經驗總結（一）
(首先聲明，此文不如分子克隆第三版權威與分子克隆相背處，請信分子克隆)增加PCR的特異性1. primers design ?? 這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件a? 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同
PCR經驗總結（二）
5. touchdown PCR?? 原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度94 5min?? 94 30s?? 60 30s?? 72 1min 2cycles?? 94 30s?? 59 30s?? 72 1min 2cycles?? 94
細胞消化經驗總結！
一、酶消化法1、胰酶。這是用得多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要作用于細胞間。配制時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存
細胞消化的經驗總結
一、酶消化法1、胰酶。這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25% 的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要作用于細胞間。配制時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活
半定量RTPCR－（SemiQuantitative－RTPCR－）
RT-PCR?AnalysisSolutions10X RT Buffer10X?PCR?Buffer100 mM Tris pH 9.0500 mM KCl1% Triton X-10025 mM MgCl2use at a concentration of 1.5 mMLysis Solutio
Standard－RTPCR
RT-PCR or reverse transcription PCR refers to PCR that uses product of an RT reaction as template. In effect, the PCR amplifies cDNA fragments. In?one
RTPCR之我見
本文討論的范圍包括RNA酶保護分析，northernblot，原位雜交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不談具體protocol，是因為各種書籍和kit說明書上都有，主要說一些原則，而且大部分是失敗和成功的經驗，還有小組討論結果以及各種書里七零八落看的內容，希望對大家有用。?基因表達的定義
RTPCR－PROTOCOL
RT-PCR PROTOCOL材料與方法…………………………………………………………????1．材料?………………………………………………………1.1?供試用組織(細胞)…………………………………1.2?主要儀器設備………………………………………1.3?主要試劑……………………………………………1.
RTPCR步驟
總RNA提取1. 取200mg組織，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。2. 震蕩30s。3. 加0.2ml氯仿，劇烈搖動30s，室溫3min。4. 12000×g，4℃ 離心，15min。5. 吸上層無色水相，移入另一EP管中（約0.5ml）。6. 加等體積異丙醇，-20℃，3
RTPCR技術簡介和RTPCR引物的選擇
RT-PCR簡介RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cD
急診科醫生經驗總結
? 1.對發熱伴頸部淋巴結腫大的青少年患者，如抗生素治療無效，要想到壞死增生性淋巴結病的可能。??? 2.對中老年昏厥患者，要優先考慮心源性的（冠脈或惡性心律失常），不管既往有無類似發作史。??? 3.以消化道癥狀為主訴的中青年患者，要想到急性重癥心肌炎的可能。??? 4.老年納差的，會不會是吞咽困
western－blot失敗經驗總結1
我做了很久的WB，最大的一個難點感覺在于樣品制備上！蛋白的降解有些時候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全沒事~~如果單獨做WB的話，感覺以“快速徹底裂解，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強的裂解液，甚至直接給loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadi
有機合成操作的經驗總結
選擇玻璃儀器和攪拌子：（1）均相反應：物料不超過容器體積的2/3；（2）非均相、回流或者產生氣體的反應：物料不超過容器體積的小于1/2，無水無氧的反應時更應注意。攪拌裝置的選擇：（1）機械攪拌：物料體積>2 L的非均相體系；（2）強力攪拌：物料體積>3 L的均相反應和250 mL~2 L的非均相體系
western－blot實驗經驗總結（二）
問題4：有陽性條帶，但條帶比較弱（1）抗體染色不充分增加抗體濃度，延長孵育時間。（2）酶活性降低直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。（3）標本中靶蛋白含量太低增加標本上樣量。（4）洗膜過度縮短洗滌時間。（5）HRP抑制劑所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。
western－blot實驗經驗總結（一）
做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，其實發現WB想要做好并不難，總結了WB實驗中可能會遇到的問題，分析了可能的原因及對應的解決方案，希望能成為你實驗成功的基石。?問題1：轉膜不充分(1)膜沒有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜。(2)靶蛋白分子量小于10 000選
尿沉渣檢驗的經驗總結
尿常規檢驗是明確患者是否患有泌尿系統疾病的常用方法。如果尿液沉渣檢驗的操作條件和程序不一致,即使是同一患者的同一尿液標本,亦可出現不同的檢驗結果,影響臨床診斷。為了探討尿液沉渣檢驗的常見影響因素,提高臨床診斷水平,我們對同一患者的尿液沉渣做了不同條件下的實驗測定。現報告如下。1．材料與方法1.1 標
有機合成后處理經驗總結
在有機合成中，后處理的問題往往被大多數人所忽略，認為只要找對了合成方法，合成任務就可以事半功倍了，這話不錯，正確地合成方法固然重要，但是機合成的任務是拿到相當純的產品， 任何反應沒有 100％產率的， 總要伴隨或多或少的副反應，產生或多或少的雜質，反應完成后，面臨的巨大問題就是從反應混合體系中分離出
western－blot失敗經驗總結2
我就跑膠和轉膜談一點兒自己的體會1、跑膠 電泳Buffer重復利用的時候要注意，不能混濁，有時候能用個3－4次，有時候第二次都不行了，事先前預電泳一下，看看氣泡的均勻度；Buffer一定要淹過梳子孔，否則就會發現今天的蛋白不會跑；跑的時候先用低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，不要追求速度，慢慢跑
川芎嗪應用經驗總結
? 川芎嗪是從中藥川芎中提煉出來的，是川芎的主要有效成分。目前，川芎嗪作為現代用藥，用作靜脈注射劑，被較多地應用于缺血性腦血管病，如：腦供血不足、腦血栓形成、腦栓塞等。??? 經過臨床表明：川芎嗪的作用還遠不止這些。只要我們深入認識它的性能，全面把握它的功用，在辨證論治的基礎上，靈活地應用它，就
NBS溴化反應經驗總結
NBS溴化試劑與溴化反應 今天下午蒸NBS 溴化后的產物，結果以下午都是眼淚鼻涕一起流，終于證實：所得產物并非溴代的2-ph-toluene，而是一個很奇怪的對眼睛和鼻子具有強烈刺激性的紅褐色液體，很失敗!弄得今天已下午心情都不好。起初還以為是乙醚或者CCl4，后來一想不太可能阿，乙醚或
手性柱的使用經驗總結
手性分離重要的是選擇一根好的手性柱，做手性分析的都知道，大賽璐的手性柱目前市場占有率高，根據用途分為多種不同的型號，大家熟悉的可能是OD-H。大賽璐公司初有四種填料，結構類似，對應的色譜柱分別是 OD、AD、OJ 和 AS，粒徑10um，后來填料粒徑變為5um，就是賣的多、使用范圍廣的柱子，號稱四大
什么是RTPCR，RTPCR的定義與檢測方法？
1.定義：是以RNA為模板，聯合逆轉錄反應（reverse transcription，RT）與PCR，可用于檢測單個細胞或少數細胞中少于10個拷貝的RNA模板。?RNA擴增包括兩個步驟： 在單引物的介導下和逆轉錄酶的催化下，合成RNA的互補cDNA；加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火
RTPCR經驗淺談
RT-PCR成敗的關鍵首先在于RNA模板的制備以問者的口氣應該是做RNA病毒基因的RT-PCR本人三年前做過一個正鏈RNA病毒全基因組分段擴增設計方案是將全基因組分成7個片段，0.6kb-3.3kb不等分別進行RT-PCR擴增剛開始的三個月我們課題組三個人辛辛苦苦什么招都想過了結果連一個片段都沒有拿
實時－RTPCR－實驗
試劑、試劑盒 RNA 模板DNA 酶緩沖液 DNA 酶 IDEPC 處理的水oligo(dT)MgCl2 dNTPEDTA實驗步驟 —、材料1. 緩沖液、溶液和試劑①10ul 消化體系的組分。RNA 模板（最多 1ug/10ul) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? xul10X
RTPCR實驗流程
1、技術原理實時熒光定量PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時檢測整個PCR進程，zui后通過Ct值與標準曲線的處理對未知樣本進行定量分析，是zui常用的基因表達分析技術。有絕對定量與相對定量兩種定量分析方法。??圖 各種熒光定量曲線示意圖2、服務流程及質控2.1?實驗流程樣本
Protocol－for－competitive－RTPCR
For quantifying mRNA, we use a competitive RT-PCR protocol with internal standard RNAs. These are added in a defined quantity to the RNA sample prior
RTPCR的原理
原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。RT- PCR（Re
RTPCR實驗步驟
一、組織抽提：1.???????取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末2.???????移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol?抽打勻漿3.???????移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打4.???????冰上孵育5分鐘5.???????離心12,000g??4℃??5分鐘?取上清液移