外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗原理和步驟
DNA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。DNA片段的克隆技術是分子操作的核心部分。 實驗目的： 學習DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將BAC克隆所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到pUC18載體上。 實驗材料： 外源片段來自一個含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆載體為PUC18。 實驗原理： 限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體pUC18多克隆位點上相應的限制性內切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現外源片段的克隆。 實驗步驟： 1．載體pUC18和外源DNA片段的限制性酶切： （50 ml反應體系，用1.5ml tube，冰上操作）： DNA 30 ml ......閱讀全文
基因克隆載體需要有哪幾個條件
用人工方法取得目的基因的適宜載體，即質粒（一種環狀雙鏈DNA）或病毒。基因克隆載體必須具備三個條件，具有能使外源DNA片段插入的克隆位點；能攜帶外源DNA進入受體細胞，或游離在細胞質中進行自我復制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復制而復制；必須具有選擇標記，以便篩選承載外源DNA的受體細胞。
分子生物學常用實驗技術（八）
第五章重組質粒的連接、轉化及篩選第一節概述 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得
DNA的克隆過程概述
DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此DNA克隆又稱分子克隆，基因操作或重組DNA技術。DNA克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的
目的基因的亞克隆
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 實驗材料
克隆化酵母DNA的操作實驗——質粒缺口修復
實驗材料酵母實驗步驟1. ?將目的基因亞克隆到YRp質粒，通過基因內的兩個限制性位點在基因中創造一個缺口區，在缺口兩側留下≥100~250 bp 的同源區，凝膠電泳純化質粒骨架大片段。?2. ?用1~10 μg?缺口質粒DNA轉化待拯救的含突變等位基因的酵母菌株，通過YRp質粒上的選擇基因進行選擇，
外源DNA的定義
外源DNA，是通過基因工程技術或病毒感染等途徑引入靶細胞中的DNA序列。
基因克隆技術概述
基因克隆技術是分子生物學的核心技術，其目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，用于深入分析基因的結構與功能，并可達到人為改造細胞以及物種遺傳性狀的目的。基因克隆的一項關鍵技術是DNA重組技術，它利用酶學方法將不同來源的DNA分子進行體外特異性切割，重新拼接組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上將
目的基因的亞克隆
目的基因的亞克隆可應用于：（1）進一步分析目的基因；（2）基因重組。實驗方法原理亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。實驗材料E.coli JM109試劑、試劑盒牛肉膏胰蛋白胨NaCl微量細菌基因組抽提試劑盒
克隆化的PCR產物連入T載體
由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。本實驗來源「分子克
DNA連接試驗
當我們已經獲得目的基因片段，選擇好適當的克隆（或表達，轉化）質粒載體， 并確定重組方案后，下面要進行的就是ＤＮＡ片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉入相應的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達（如現代基因工程藥物的生產），還可用于序列分析和轉基因等重要生物技術的研究中。?DNA
大腸桿菌感受態細胞的制備、重組DNA的轉化、克隆篩選－一
1. 實驗目的和要求通過本實驗學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞和外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。2. 相關知識及原理感受態細胞(Competent cells)：受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學試劑法）
重組質粒的轉化、篩選和鑒定操作
摘要： 學習克隆工作中最常用的雙酶切,將外源基因與質粒連接方法及操作技術. 一、實驗目的： ?1、學習克隆工作中最常用的雙酶切；2、學習將外源基因與質粒連接方法及操作技術；3、學習氯化鈣法制備 大腸桿菌 感受態細胞的技術；4、了解細胞轉化的概念及
克隆化的PCR產物連入T載體
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graha
克隆化的PCR產物連入T載體
實驗方法原理 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991
在低熔點瓊脂糖中連接質粒和目的DNA實驗
質粒克隆操作最費時間的步驟是用電泳的方法對預期大小的外源 DNA 片段和質粒 DNA 片段進行純化，可以用于將質粒和外源 DNA 的連接在低熔點球脂糖存在的條件下完成實驗方法原理質粒克隆操作最費時間的步驟是用電泳的方法對預期大小的外源 DNA 片段和質粒 DNA 片段進行純化，在以下的方案中（取自S
基因的轉移與重組體的篩選和鑒定4
（3）插入表達篩選法與插入失活相反，插入表達法是外源目的基因插入特定載體后，能激活用于篩選操作的標記基因的表達，由此進行轉化子的篩選。設計載體時，在篩選標記基因前面連接一段具有抑制作用的負調控序列，插入外源DNA將使該負調控序列失活，其下游的篩選標記基因才能表達。例如質粒pTR262有一個負調控的c
克隆載體的功能作用及常見的載體介紹
克隆載體通常采用從病毒、質粒或高等生物細胞中獲取的DNA作為克隆載體，在載體上插入合適大小的 外源DNA片段，并注意不能破壞載體的自我復制性質。將重組后的載體引入到宿主細胞中，并在宿主細胞中大量繁殖。常見的載體有質粒、噬菌粒、酵母人工染色體。
關于人工染色體克隆載體的介紹
人工染色體克隆載體實際上是一種穿梭克隆載體,含有質粒克隆載體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質粒復制起始位點,還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和復制起始位點的序列,以及合適的選擇標記基因。這樣的克隆載體在第一受體細胞內可以按質粒復制形式進行高拷貝復制,在體外與目的DNA片段重組后
關于黏性質粒載體的簡介
由于真核基因的結構與功能研究的需要，人們發展出比λ噬菌體載體具有更大克隆能力的新型的載體——柯斯質粒載體(cosmid vectors，cosmid是COS site—carrying plasmid的縮寫)，也稱為黏陛質粒或黏粒。這是一類人工構建的含有抗性基因、單一克隆位點以及λDNACOS位
分子克隆常用載體
分子克隆常用載體 DNA片段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用
M13噬菌體載體的克隆
雖然理論上 M13 重組噬菌體所能攜帶的外源 DNA 片段沒有限制，但實際上是有限的：長片段的外源 DNA 比短片段的更易發生缺失和重排。因此如果可能，最好克隆至 M13 噬菌體的 DNA 片段不要大于 1000 堿基。而且，當用“正向”或“反向”通用測序引物進行 DNA 測序時，大片段的中心區域可
關于黏粒的基本信息介紹
黏粒英文cosmid，指帶有黏端位點(cos)的質粒。黏粒是由人工構建的含有λ噬菌體DNA的cos序列和質粒復制子的載體。黏粒的組成包括質粒復制起點（ColE1）、氨芐青霉素抗性標記、cos位點。黏粒有4個特點： ①具有λ噬菌體的特性。黏粒在克隆了外源DNA在體外包裝成噬菌體顆粒后，可以感染宿
分子克隆的常用載體介紹
DNA片段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆
分子克隆常用載體（質粒、單鏈絲狀噬菌體和噬粒）
DNA 片段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲
分子克隆的常用載體
DNA片段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆
cDNA感染性克隆的概念和原理
cDNA克隆是以mRNA為原材料，經體外反轉錄合成互補的DNA(cDNA)，再與載體DNA分子連接引入寄主細胞。每一cDNA反映一種mRNA的結構，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特點是：①有些生物，如RNA病毒沒有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易篩選，因為cDNA庫中不包含非
如何提高DNA片段的轉化率
一、克隆分析原理克隆分析用于將DNA片段從一個載體（質粒、黏粒或噬菌體）轉移到另一個載體上。它們通常用于構建表達系統，或是將DNA片段轉移到特殊的載體上以制備雜交探針或是制備測序用的單鏈模板。典型的載體含有三個必要的元件：一個抗生素抗性標記、一個復制起點（以便選擇轉化了的大腸桿菌宿主）以及一個或多個
質粒克隆載體的設計和構建的原則
①選擇合適的出發質粒出發質粒也叫親本質粒，它應含有質粒克隆載體必備的元件，如復制起始位點、選擇標記基因、克隆位點、啟動子和終止子等。②正確獲得構建質粒克隆載體的元件一般采用限制性核酸內切酶切割出質粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA片段，還可以采用PCR技術從靶DNA中擴增出含某種元件的特異性DN
如何閱讀基因載體圖譜？（一）
基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強有力的生物工具，我們先來認識和閱讀載體圖譜吧。?一、載體分類及載體組成元件載體分類1、按屬性分類：病毒載體和非病毒載體病毒載體是一種常見的分子生物學工具，可將遺傳物質帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入目的細胞，進行感染的分子機制。可發生于完整活體或
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體3
在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條