體外DNA重組技術4
（二）質粒的大量制備:1.將5ml轉化菌種接種于500ml LB培養液(含用于篩選的抗生素)中，37℃以225rpm速度振蕩培養12～16小時；2.10,000rpm，4℃離心15min收集菌體；3.將細菌懸浮于100ml預冷的STE（0.1M NaCl，10mM Tris.Cl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0）中，12,000rpm離心收集菌體；4.將菌體懸于10ml細菌懸浮液中，再移至50ml離心管中；5.加入1ml用10mM Tris.Cl (pH 8.0)新鮮配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，混合后室溫孵育30min；6.加入15ml新鮮配制的細胞裂解液，上下顛倒混合直至溶液變黏稠為止；7.加入10ml預冷的中和液，上下顛倒混勻，冰浴10min；8.12,000rpm，4℃離心20min；9.將上清通過四層消毒紗布濾入另一50ml離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置10min，12,000rpm，室溫......閱讀全文
體外DNA重組技術-4
（二）質粒的大量制備:1.將5ml轉化菌種接種于500ml LB培養液(含用于篩選的抗生素)中，37℃以225rpm速度振蕩培養12～16小時；2.10,000rpm，4℃離心15min收集菌體；3.將細菌懸浮于100ml預冷的STE（0.1M NaCl，10mM Tris.Cl，pH8.0，1mM
體外DNA重組技術-3
【實驗試劑與器材】（1）Oligo(dT)纖維素（2）層析柱裝置（3）1×上樣緩沖液：20mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸鈉(SLS)配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液，加入各成分確切
體外DNA重組技術-6
六、重組質粒的轉化【實驗目的】學習和掌握感受態細胞的制備方法和轉化實驗的基本操作。【實驗原理】將重組質粒轉入大腸桿菌的過程稱為轉化。轉化所用的大腸桿菌需要用物理或化學方法特殊處理，使重組DNA分子容易進入細胞內，被處理后易于接納DNA分子的細胞稱作感受態細胞。下面介紹感受態細胞的制備。【實驗試劑與器
體外DNA重組技術-5
（三）DNA酶切片段的回收【實驗方法與步驟】1.凍融法:（1）在UV燈下，用手術刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，-70℃冷凍至少 15min，然后在65℃水浴中使膠融化；（2）加入等倍體積TE-飽和酚，劇烈振蕩30秒鐘，然后-70℃冷凍 15min；（3）室溫融化后，12,000rpm離心5mi
體外DNA重組技術-2
【注意事項】基因組DNA分子量大，所有操作必須輕柔，酚/氯仿對皮膚有腐蝕作用，應該戴手套操作。二、RNA的制備【實驗目的】1.理解生物細胞中RNA制備方法的原理。2.熟悉組織細胞中RNA制備的基本操作。（一）細胞總RNA的提取1.異硫氰酸胍法【實驗原理】異硫氰酸胍法提取細胞總RNA是目前常用的提取方
體外DNA重組技術-1
在體外將兩個或多個來源相同或不相同的DNA片段連接成新的重組DNA分子，再轉到特定宿主細胞中進行自主復制并表達。這是分子生物學中的基本技術。DNA重組技術的基本程序包括：（1）獲得外源DNA：外源DNA是進行DNA重組的目的DNA片段，一般采用 DNA聚合酶鏈式反應(PCR)或逆轉錄-DNA聚合酶鏈
DNA重組技術
連接反應的策略?? 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：────────────────────────────────
DNA重組（DNA recombination）技術：外源基因的蛋白表達-4
（3）CHO細胞穩定表達系統：動物細胞瞬時表達系統中外源基因沒有穩定地整合到宿主細胞染色體中，一染色體外DNA的形式存在。因而只能瞬時表達。要使外源基因在宿主細胞中高效、穩定地表達，必須建立一個穩定表達系統，包括適宜的表達載體、有效的基因轉染、標記基因和目標基因的選擇與共擴增、受體適當的受體細胞和培
DNA重組技術(DNA Recombination)
一、DNA 的酶切與連接（1）酶切反應：同質粒DNA 的鑒定，只不過是質粒DNA 換為載體DNA 。若大量酶切，則成比例增加。（2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。（3）15000rpm離心15min，棄上清。（4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄
DNA重組（DNA recombination）技術：DNA重組與鑒定-3
當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色，見圖7-11 。如果外源DNA插入片段相當短，不破壞β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的閱讀框，有時產生的重組體菌落不呈白色而是呈淺藍色。4