integrate基因工具應用

　　哥倫比亞大學的研究團隊在霍亂弧菌中發現了一個獨特的“跳躍基因”（轉座子）后，開發了一種名為INTEGRATE的工具，可以在基因組中精準位置插入大片段基因而不引入DNA斷裂。對于側重于敲除和降解目標DNA、且屢受到脫靶困擾的CRISPR技術，這種新的、精準插入大片段的基因編輯工具有望提供重要的補充。

　　CRISPR技術的應用前景和限制，極大地推動了科學家們研究改良各種基因編輯工具的熱情。哥倫比亞大學的研究團隊在霍亂弧菌中發現了一個獨特的“跳躍基因”（轉座子）后，開發了一種名為INTEGRATE（“Insertion of transposable elements by guide RNA-assisted targeting.”縮寫，引導RNA輔助靶向的轉座元件插入）的基因編輯工具，可以在基因組中插入大片段基因而不引入DNA斷裂。在今天發表在《 Nature》雜志上的新研究中，研究人員利用冷凍電鏡技術，揭示了INTEGRATE的基因編輯復合體的高分辨率細節圖像，有助于揭示其工作原理。這是科學家捕獲這種新的基因編輯工具的第一張圖像，有望改進現有的基于CRISPR的工具。

　　開始像CRISPR，但結局不同

　　面對病原體攻擊時，細菌利用CRISPR和Cas基因編碼的適應性免疫系統來保持基因組完整性。I型CRISPR-Cas系統通常通過核糖核蛋白復合體Cascade和解旋酶——核酸酶Cas3的聯合作用靶向外源DNA，并使之降解。研究人員利用缺少Cas3的核酸酶缺陷型I系統、結合一個來自霍亂弧菌的Tn7樣的轉座子（Tn6677），實現了由引導RNA輔助的大片段DNA精準插入（而不是降解失活）。

　　為進一步了解CRISPR與轉座子相關的機制如何在DNA靶向和插入過程中協同工作，研究人員使用冷凍電鏡的技術，在液氮中快速冷凍由霍亂弧菌Tn6677轉座子編碼的TniQ–Cascade復合物的樣品并用電子轟擊，在電子顯微鏡下捕獲的圖像生成TniQ–Cascade的原子分辨率模型，從而有助于揭示這種功能性偶聯的機理基礎。

　　低溫電鏡圖實現了對轉座蛋白TniQ的從頭建模和完善細化——TniQ蛋白以二聚體頭尾相接的形式與Cascade復合物結合，結合到靠近CRISPR RNA（crRNA）3'端、Cas6和Cas7形成的界面。天然Cas8–Cas5融合蛋白則結合到5'crRNA端，并通過可變的插入域與TniQ二聚體接觸。靶DNA結合結構揭示了PAM（protospacer-adjacent motif）識別和R環形成所必需的關鍵相互作用。這項工作為從結構上了解TniQ–Cascade的DNA靶向如何在后繼募集下游轉座酶蛋白質奠定了基礎，并將為今后在基因組工程應用中如何利用該系統進行可編程DNA插入提供蛋白質設計上的指引。

　　結構模型表明，該復合物由兩個主要部分組成，排列成螺旋形絲狀。較大的部分稱為Cascade，纏繞起來并攜帶一段引導RNA——這是用來掃描細胞以尋找DNA中的匹配序列。一旦它定位并結合到靶序列上，它將引導DNA鏈穿過位于復合物末端的TniQ“轉座”蛋白，并募集其他有助于修飾DNA的酶。

　　INTEGRATE的掃描機制與其他CRISPR系統類似（部分CRISPR系統也包含帶有引導RNA的Cascade復合體）。但是不同之處在于，CRISPR系統使用Cascade靶向DNA進行切割，而INTEGRATE中Cascade的功能是靶向DNA以便高精度插入DNA。

　　在他們之前的研究中，Sternberg及其同事使用遺傳學和生物化學方法提出了CRISPR機制如何與轉座機制——負責基因“跳躍”的分子——進行功能連接，這項研究證明了他們的假設是正確的。

　　為什么重要

　　現在，世界各地的許多研究人員都在使用CRISPR-Cas9快速廉價地對細胞基因組進行精確修飾。但是，CRISPR的大多數用法包含切割目標DNA的兩條鏈，然后必須通過宿主細胞自身的機制修復DNA斷裂。控制該修復過程仍然是該領域中的主要挑戰，并且常常出現無意間將非預期的基因編輯引入了基因組中。此外，現有基因編輯工具在以精確方式插入較大的基因片段時通常效果不佳。提高基因編輯的準確性是研究人員的當務之急，這對于確保使用此技術開發的療法的安全性至關重要。

　　由Sternberg實驗室開發的新型INTEGRATE系統可以準確地插入大的DNA序列，而無需依靠細胞機制來修復雙鏈。與廣泛使用的原始CRISPR-Cas系統相比，INTEGRATE被證明是更準確和有效地進行某些基因修飾的好方法。該新工具還可以幫助科學家在DNA修復活性有限的細胞類型中進行基因編輯——例如神經元，使用CRISPR的嘗試相對而言不太成功。

　　下一步工作

　　除了能為將來如何利用基因工程繼續改良這個系統提供有效信息，這些結構圖還突出了一個可能的校對檢查點。現有的CRISPR技術經常受困于“脫靶效應”。新結構圖揭示了INTEGRATE系統中Cascade和TniQ如何協同工作，以確保僅允許“正中目標”的序列被標記從而進行DNA插入。這個機制可能對CRISPR系統改造具有意義。研究人員計劃進一步探索該檢查點，以便將來可以成為開發用于疾病的新治療方法的工具。

　　“以這種級別（電鏡級別）讓生物學可視化，確實令人驚奇，甚至可以使那些不熟悉該領域的人都感到興奮。”哥倫比亞大學歐文醫學中心細胞，分子和生物物理研究專業的博士生Tyler Halpin-Healy說，他是該研究的第一作者。

　　哥倫比亞大學生物化學與分子生物物理學助理教授Sam Sternberg博士說：“這些新圖像。。。以令人難以置信的分子細節解釋了生物學，有望通過指導如何進行蛋白質工程改造來幫助改良這一系統。”