基本方案
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | 純化的 mRNA 顯示蛋白 |
| 試劑、試劑盒 | NaOH HCl NaCl MgCl2 乙醇 1-丁醇 苯酚 氯仿 異戊醇 EDTA PCR 緩沖液 ATP 瓊脂糖 ATP-適配體篩選結合緩沖液 ATP-適配體篩選洗脫緩沖液 鮭精 DNA BSA 3'引物 5'引物 Taq DNA 聚合酶 |
| 儀器、耗材 | 凝膠過濾柱 |
| 實驗步驟 |
實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」 1. 用 1 ml 去離子水洗滌 10 mg ATP-瓊脂糖三次，然后用 1 ml ATP-適配體篩選結合緩沖液洗滌兩次。 2. 取 1 ml 所得的純化的 mRNA 顯示蛋白與洗過的 ATP-瓊脂糖于 4°C 下 旋轉混合孵育 1 h。然后滴干，準備過柱。 3. 于 4°C 用 1000 ml ATP-適配體篩選結合緩沖液洗滌 6 次，每次洗滌 10 min。 4. 用 250 ul ATP-適配體篩選洗脫液于 4°C 下洗脫 6 次，每次洗脫 10 min。 5. 用閃爍計數法檢測所有組分。 6. 往 1.5 ml 洗脫下的 mRNA 顯示蛋白中加入 200 ul 100 mmol/L EDTA 和 200 ul 1 mol/L NaOH，于 90°C 加熱 10 min， 冰上冷卻，然后加入 200 ul 1 mol/L HCl。 7. 參照廠家的說明用 NAP-25 凝膠過濾將緩沖液置換為去離子水。 8. 使 25 ml 去離子水流過柱子。 9. 將 200 ul 10 mg/ml 鮭精 DNA 與 20 ul 1 mg/ml BSA 加入 1780 ul去離子水中，渦旋振蕩，然后使此溶液流過凝膠過濾柱。 10. 使 25 ml 去離子水流過柱子進行洗滌。 11. 測量樣品體積并流過柱子，然后往柱中加入一定體積的去離子水，使得上柱總體積為 2.5 ml。 12. 加入 3.5 ml 去離子水到凝膠過濾柱的頂端，然后從柱底收集 3.5 ml 流出的洗脫液。 13. 用 PCR 擴增篩選的序列。在冰上配制下列 PCR 反應混合物： 3500 ul 篩選的 cDNA 庫（來自步驟 12） 100 ul 100 umol/L 3' 引物（最終為 2 umol/L） 100 ul 100 umol/L 5' 引物（最終為 2 mmol/L） 40 ul 25 mmol/L （每個）脫氧核苷三磷酸（最終為 0.2 mmol/L） 500 ul 10×PCR 緩沖液，含 15 mmol/L MgCl2 （最終為 1×） 735 ul 水 25 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶 總體積 5000 ul 循環數、溫度和每一循環所需時間需要視所用的特定的庫而定。應當對 DNA 庫的 PCR 擴增監控，避免 DNA 庫的過度擴增，因為（過度的擴增使得 DNA 庫）一旦變性后不會再復性。如果對一個變性的 DNA 庫繼續進行 PCR 擴增，極少的序列能達到普通序列的擴增程度，這會降低所篩選的功能序列的富集因子。 14. 與上述 PCR 并行進行一份非 RT 的對照 PCR。 15. 按照 1：1 等量摩爾數加入 100 mmol/L EDTA 以螯合 Mg2＋。 16. 加入等體積的 25：24：1 （V/V/V） 苯酚/氯仿/異戊醇到 PCR 反應混合物中，渦旋振蕩，室溫下于 10 000 g 離心 1 min。吸取上層水相保留。 17. 用等體積的氯仿重新抽提水相 3 次；每次通過離心分層，離心后棄下層有機相。 18. 用 1-丁醇抽提水相至起始體積的 20％，棄上層 1-丁醇相。 19. 加入 3 mol/L NaCl 至終濃度為 300 mmol/L （在計算濃度時應包含來自 PCR 緩沖液的鹽濃度）和 2.5 倍體積的 100％ 乙醇。 20. 于 -80°C 冷凍 20 min 或于 -20 ℃ 放置過夜。4°C 下 12 000 g 離心 10 min。棄上清。 21. 沉淀于 12 000 g 離心 1 min， 用塑料吸頭吸去殘留的上清，溶解于 30 mmol/L NaCl， 用瓊脂糖凝膠測量其濃度。 22. 重復篩選/擴增循環直至所得的 mRNA 顯示蛋白在選擇組分中的比例不再提高為止，通常需 8～12 個循環。 23. 將 DNA 轉錄成 RNA。
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| 注意事項 | |
| 其他 |
1. 材料 純化的 mRNA 顯示蛋白 2. 試劑 ATP 瓊脂糖（Sigma） ATP-適配體篩選結合緩沖液 ATP-適配體篩選洗脫緩沖液 100 mmol/L EDTA 1 mol/L NaOH 1 mol/L HCl 10 mg/ml 鮭精 DNA 1 mg/ml BSA 100 umol/L 3'引物（cDNA 庫特異的） 100 umol/L 5'引物（cDNA 庫特異的） 25 mmol/L （每個）脫氧核苷三磷酸 10×PCR 緩沖液，含 15 mmol/L MgCl2 （Boehringer Mannheim） 5 U/ul Taq DNA 聚合酶（Boehringer Mannheim） 25：24：1 （V/V/V） 苯酚/氯仿/異戊醇 氯仿 1-丁醇 3 mol/L NaCl 100％ 乙醇 3. 耗材 凝膠過濾柱（如 NAP-25，Amersham Pharmacia Biotech）
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