GEN：引領癌癥免疫治療的“四駕馬車”

　　近些年來，一場癌癥治療的革命正在悄然發生，除了依賴于一種又一種的人工分子來診治癌癥，科學家們正在尋求通過病人自身免疫功能治療惡疾的方式。

　　現在，癌癥免疫療法主要面臨著三大任務：增強癌細胞免疫靶標性，提高特異免疫分子的癌細胞擊殺率以及提高免疫細胞的腫瘤靶向性。

　　自腫瘤免疫治療出現伊始，這一領域便處于不斷進化的狀態，現在，腫瘤免疫治療領域的相關實驗已經在各大實驗室得到了開展，腫瘤免疫的通路分析引導著臨床療法的不斷發展，同時也在很大程度上提高了癌癥的治療水平。

　　為了進一步了解腫瘤的免疫療法，我們必須了解免疫系統如何產生針對腫瘤細胞的特異反應。在這一系列反應中， T細胞扮演著最為重要的角色，在腫瘤免疫過程中對來自各種癌細胞的信號分子產生特異反應。

　　1. T細胞的主場

　　西雅圖生物公司Adaptive Biotechnologies合伙人和首席科學家Harlan Robins博士表示，“生物體各個細胞遺傳物質完全相同的理論對于T細胞與B細胞來說并不完全適用，T細胞B與細胞在人體內會產生大幅度的DNA重排。”

　　免疫學家把這一過程稱為VJD重排，這一過程主要發生在T淋巴細胞發育的過程中，對三個基因區域產生一定程度的影響（可變區V，多樣區D以及連接區J）。這種基因重排直接導致了T細胞表面抗原特異性受體結構的多樣性，其中便包括針對于腫瘤細胞表面抗原的特異受體結構。

　　如何使用PCR量化的免疫細胞的克隆多樣性

　　大多數情況下，癌癥免疫療法所面臨的最突出問題集中在刺激免疫系統攻擊癌變細胞。科學家們意識到除非能夠有效促進病人體內無性分裂的多樣T細胞發生定向分化，癌癥免疫治療都有效實施都會變得格外艱難。為了解決這些問題，現有的諸如光譜分型等技術是遠遠不夠的。2007年，當Robins博士和他的同事們開始開發免疫治療技術的時候，業內立足于傳統理論報道T細胞受體編碼序列的相關文獻只有約1萬篇。

　　Robins博士回憶說，“當年腫瘤免疫領域的相關研究并為與高通量測序技術結合，而現在，高通量測序技術使我們能夠更加清楚而深刻地認識T細胞表面受體編碼序列。”

　　Robins團隊的首次實驗便得到了6百萬個T細胞表面受體編碼序列，這樣的實驗結果也在某種程度上使Robins團隊的研究規模發生了極大的變化。Robins團隊在隨后開發了更為先進的多倍測序技術用于免疫系統的測序工作，進而促進了免疫治療序列分析領域產生與發展。“在我們之前，沒有任何人做到如此大量的多重PCR。”Robins博士強調。

　　Adaptive Biotechnologies的主力產品ImmunoSEQ assay使用幾百個引物對T細胞多樣性克隆產物進行量化分析。通過這項技術，科研人員和臨床醫師可開發針對于某種特異循環流細胞表面抗原的特異T細胞克隆。

　　Robins 博士解釋說，“很明顯，你很難得到病人的腫瘤樣本，但是你可以輕松獲得他們的血樣。”因為能夠特異免疫細胞在病人體內起到預期作用，ImmunoSEQ assay已經被應用于白血病的臨床評估，基于單個患者T細胞或B細胞的大量擴增來直接追蹤患者的白血病。

　　最終，Robins博士團隊希望在治療干預之前、之中以及之后對T細胞克隆體的不同變化進行監控。研究團隊甚至開發了一種腫瘤滲透淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte ，TIL)化驗來研究對腫瘤具有明顯趨向性的T細胞擴增。

　　2. 循環腫瘤細胞

　　Daniel Adams, Creatv MicroTech資深研究科學家說“幾年前，人們僅僅對腫瘤中發生著什么有興趣。而現在，人們逐漸開始關注癌癥患者中免疫系統對腫瘤的特殊反應。”

　　與Adams研究方向類似的科學家們一直在研究著腫瘤細胞與腫瘤細胞改造而成的基質細胞，同樣，這些科學家也在研究著非適應性免疫反應，直接檢測癌癥患者血液成分隨時間的變化。

　　“我們不能在每年都和每次他們發病的時候對研究對象做二次活檢，現實條件很難允許我們做到對單個患者的長期研究。”這一現狀在某種程度上直接導致了Creatv MicroTech在馬里蘭與新澤西建立分公司，該公司開發的細胞過濾器CellSieve通過更先進的內置聚合物與工學設計對傳統技術進行了極大的提高，能夠更高效地對循環瘤細胞與其他基質細胞進行分離，用于后續的臨床分析。

　　“癌癥患者進行免疫治療的過程中，病人的抵抗力會得到重建，癌變則以不同亞型的方式重復發生。在治療幾年之后，原發腫瘤團塊將不會再具有分裂與增值能力。”Adams表示。

　　雖然循環瘤細胞在病人血流中數量極微，每5至10毫升血液中僅有一兩個循環瘤細胞。雖然這些血液中的循環瘤細胞活性極低，他們對于癌癥患者與臨床醫師來說具有不可替代的預診斷價值。

　　“我們在兩年間對30多位乳腺癌患者進行了調查，循環瘤細胞成功分離患者的兩年內死亡率高達90%，兩年半內的死亡率高達百分百。”Adams表示。

　　此外，現有的技術使得對癌癥免疫反應的追蹤成為了可能。通過檢查基質細胞，CellSieve濾過裝置可對不同的細胞流進行收集與檢測，進而對集體免疫反應進行評估。

　　Isolation, culture and expansion of cells isolated on CellSieve?. (A) MCF-7 cells spiked into vacutainers, isolated by filtration and cultured on CellSieve for 2-3 weeks. A 3 dimensional cluster attributed to this cell line is seen on the filter. (green=anti-cytokeratin, blue=DAPI) (B) PANC-1 cells spiked into vacutainers, isolated by filtration and grown on CellSieve for 2-3 weeks. PANC-1 is seen growing as a monolayer on the filter. (C) SKBR3 cells are spiked into blood, filtered by CellSieve. The CTCs are identified by presence of anti-cytokeratin and anti-EpCAM, and absence of anti-CD45. After CTCs are counted, cells are subtyped by HER2 FISH. (D) SKBR3 cells are spiked into vacutainers, isolated by filtration and grown on CellSieve for 2-3 weeks. Expanded colonies were directly analyzed as a whole colony and as individual cells, molecularly by HER2/CR17 FISH probes. (E) Circulating stromal cell, e.g. a 70 ?m giant cancer associated macrophage can be identified for clinical use, myeloid marker in red. (F) A cell of interest can be identified and restained with immunotherapeutic biomarkers, e.g. PD-L1 (green) and PD-1 (purple). (G) After filtration, cells were identified with histopathological stains (e.g. H&E) for cytological analysis. (H) After H&E, external cell structures were analyzed by SEM. [Creatv MicroTech].

　　目前，許多研究進展有效地支持了腫瘤發育環境基質細胞與腫瘤細胞共同進化的推論，指出基質細胞標記物的變化能夠在很大程度上反應腫瘤細胞的代謝變化。而對于循環系統中腫瘤細胞與基質細胞的檢測與分析可以在為研究人員與臨床醫師提供大量的病理學、生物標記以及分子生物學參考。

　　3. 抗癌試驗

　　在目前的癌癥生物學領域中，大量不同的技術儀器扮演著不可或缺的角色。技術儀器的發展促進著診斷技術的進步，而后者的進步也在更大程度上催生著儀器開發與制造商的不斷創新，免疫與腫瘤診斷技術進展在很大程度上體現了這一技術與經濟的良性循環。隨著腫瘤免疫治療的不斷發展，腫瘤的免疫治療將與癌癥生物學充分結合，補充與豐富現有的產業資本循環形式。

　　ACEA Biosciences技術轉化科學家Brandon Lamarche博士說:”毋庸置疑，免疫治療將在未來的癌癥治療中扮演不可或缺的角色，不論具體的實現形式如何，有效的癌細胞免疫殺傷實驗都是這一行業走向頂峰所必須的標志。”

　　位于圣迭戈的技術公司ACEA Biosciences開發了一種微量滴定板，這種滴定板的底部約75%的面積涂布著金屬電極。ACEA的酶標儀xCELLigence可通過電極阻抗變化來對細胞形態與生存能力進行檢測與評估。研究人員可以通過相關試劑或非粘著性免疫細胞懸浮液對癌細胞進行追蹤與功能檢測。

　　Lamarche博士認為xCELLigence技術系統有效地解決了細胞殺傷實驗所面臨的一些問題。通過xCELLigence，研究人員與臨床醫師可以獲得細胞代謝的全波段光譜。ACEA認為xCELLigence將會成為癌癥患者臨床細胞殺傷實驗的新標準。

　　4. 腫瘤免疫治療的生物信息學

　　從病情監控到疾病治療，癌癥免疫治療領域每時每刻都離不開生物信息學的輔助。目前，全球著名信息服務供應商湯森路透的分析師們正在通過編譯數據檔案和應用先進的分析技術尋找新的免疫治療靶標。湯森路透生命科學部首席科學家Richard Harrison醫生表示，“從本質上來說，在藥物開發的每一個階段，我們都有一個專門的數據庫與之關聯。”

　　湯森路透的分析師以及諸如MedaCore與Cortellis的編譯數據庫都向客戶提供與他們科研或臨床服務相關的技術支持。“我們可以獲取客戶的有關數據，使用我們的工具與技術手段幫助他們充分了解他們數據所包含的一切信息。”Harrison博士表示。

　　湯森路透對策科學家Matt Wampole博士致力于與客戶合作，幫助他們了解與熟練使用該公司的技術產品。“我們擁有許多在這一領域經驗豐富的專家學者，諸如生物統計學專家，專業的數據監控師與數據分析師將為顧客提供諸如模型識別、患者分層、機制解析與病理深入研究等相關服務。”

　　Harrison醫生對湯森路透的相關工作總結如下：“我們尋找癌癥免疫治療過程中的主要調控分子并將之作為治療靶標以及生物標記，通過分析與比對患者與策劃數據庫的基因簽名來對患者進行深度分類，進而為他們提供最佳的個性化用藥與治療指導。”

　　“我們正與數家制藥公司開展合作，將我們的方法付諸于臨床實踐。目前，我們的研究與治療方法已經在幾個科研項目中得到了應用，其中包括通過細胞系數據分析預測癌癥患者藥物反應與膠質母細胞瘤患者分層。”Harrison說。