納米粒子輔助量化腫瘤特異外泌體用于胰腺癌診斷

　　盡管人們在疾病診斷技術上的投入巨大，但是許多病癥的診斷方法仍然既繁瑣又昂貴，并且往往難以在癥狀不明顯的早期及時發現疾病。胰腺癌就是一個典型例子：早期胰腺癌并無明顯癥狀，但病情發展卻十分迅速。事實上，根據美國癌癥協會（AmericanCancerSociety）統計，高達80%的胰腺癌患者在確診后的一年內死去。

　　近日，美國亞利桑那州立大學“VirginiaG.Piper個體化診斷生物設計”研究中心的胡曄教授和他的同事們設計了一種精巧的方法，來解決胰腺癌早期診斷的問題。這種診斷方法的基本原理是對血液中的腫瘤特異細胞外泌體（extracellularvesicles，EVs）的高靈敏檢測。

　　在NatureBiomedicalEngineering雜志最新在線發表的這項研究中，胡教授和他的同事報道了該方法：它能夠直接檢測源自腫瘤細胞的EVs，這些囊泡上攜帶了特定的膜蛋白作為胰腺癌的標志物。準確測定這種名為EphA2的膜蛋白，使得這些腫瘤EVs能夠用于診斷早期胰腺癌。

　　胡曄教授介紹：“胰腺癌是一種極其需求早期血檢標志物的癌癥”。目前，胰腺癌的唯一有效治療手段仍然是手術切除患病組織。但是，由于胰腺癌快速的進展，在確診過程期間就容易發生擴散，使得手術治療往往變得不再可行。“也有一些其他的胰腺癌檢測技術，但是由于這種癌癥的特征，使得這些技術的效果往往比較有限。在毫無癥狀時通常很難捕捉到疾病的早期信號。它不像乳腺癌，患者能夠感覺到疼痛，從而容易檢查到不正常的增生”。

　　這項工作通過兩個不同納米粒子之間的相互作用檢測腫瘤分泌的EVs，進而可利用這種方法將胰腺癌患者的血液樣品與胰腺炎患者（與胰腺癌有相似的癥狀）及健康人的血樣區分開來。更重要的是，不同疾病都有其特異性的EVs，因而這種技術能夠進一步用于更廣泛疾病類型的快速靈敏檢測。

　　聚焦EVs

　　真核細胞（包括人類細胞）和原核細胞（比如細菌細胞，它們缺少細胞核及一些其他膜成分）都會分泌EVs。EVs可以看作是其來源母細胞的縮小版，雖然囊泡中并不存在細胞中復雜的細胞器。

　　細胞通過不同的路徑分泌不同類型的EVs。本研究關注的是一種稱為“外泌體（exosomes）”的囊泡，它的尺寸大約在50-150納米的范圍。外泌體來自于細胞內部一種名為“內涵體”的膜結構中，內涵體的膜結構會最終與細胞質膜相融合，同時將外泌體釋放到胞外空間。

　　曾經人們認為EVs僅僅是細胞代謝活動的遺留物，但是現在研究者逐漸意識到EVs承擔著關鍵性的遠程運輸職能。人們對這一問題的研究還處于起步階段。EVs構成了細胞間極其精密復雜的通訊網絡，并且在不同物種間高度保守，顯示了它們在生命過程中的重要作用。其生物活性之一是在不同細胞間轉運核酸、蛋白質、和脂質，進而在母體細胞和靶細胞引發生理或病理變化。在先天性免疫和獲得性免疫響應中EVs也扮演了重要的角色。

　　EVs指示健康與疾病

　　研究顯示，在許多疾病中，循環系統中的EVs數量會顯著升高。在特定癌癥的發生和發展中，EVs也扮演了重要的角色，包括胰腺癌。腫瘤EVs離開其母體細胞，遷移到其他正常組織，能夠影響目標組織的周圍環境，創造出一個適合腫瘤浸潤和生長的微環境，這是EVs在腫瘤轉移中的一個顯著功能。就像新大陸的拓荒者，EVs能夠為后續癌細胞的入侵開辟道路。

　　也有證據表明，腫瘤來源的外泌體能夠通過排出抗腫瘤藥物或“中和”抗體藥物來增加腫瘤細胞的抗藥性。

　　由于血液中腫瘤來源的EVs水平會隨著腫瘤生長而增加、同時隨著癌癥的有效治愈而下降，因此EVs有可能作為快速評估癌癥進展和治療響應的一個非手術指標。

　　發現像EphA2這樣的腫瘤EVs蛋白，以及更好的理解EVs在腫瘤發生和轉移過程中的作用，將為癌癥診斷和預后監控翻開新的篇章。由于胰腺癌化療中發生藥物耐受的幾率較高，人們同樣亟需有效的胰腺癌預后監控手段，從而能夠及時修正個體化治療方案、改善療效。并且，更好的理解與癌癥有關的EVs上的特異性活性因子，有可能發現新的癌癥治療靶點、促進個體化癌癥治療的發展。

　　臨床診斷界的曙光

　　EVs能夠從非常廣泛的細胞類型和生物體液（如唾液、尿液、血液、乳汁、精液、羊水以及鼻腔和氣管灌洗液）中分離出來，使得EVs成為一種極具潛力的疾病標志物來源。但是，主要問題在于，如何將疾病相關的EVs與體液中的其他普通EVs區分開來。現有的EVs分析手段往往需要復雜繁瑣的EVs分離和純化過程，難以在臨床機構中推廣。能夠準確鑒別疾病相關EVs的有效標志物與方法更是無從談起。

　　這里所發展的基于納米粒子的技術，能夠通過簡單的樣品處理，快速檢測腫瘤相關的EVs，解決了上述提到的問題。

　　極微量的血液（最小可達1微升，小于一滴眼淚的體積）在經過稀釋后滴加到一片傳感芯片上，芯片表面修飾了一層EVs膜蛋白的抗體。EVs通過這個抗體被捕獲到芯片表面，然后與兩種抗體修飾的納米粒子相互作用——綠色的納米球識別第二個EVs表面膜蛋白，紅色納米棒識別胰腺癌標志蛋白EphA2。只有胰腺癌組織分泌的EVs能夠同時結合兩種納米粒子。這兩個納米粒子由于結合在一個囊泡上，引起二者近距離的偶合作用，進而顯著改變了它們折射光的顏色和強度，這種改變在暗場顯微鏡下能夠清楚的觀察到（如圖所示）。

　　胡教授和他同事進行的一系列實驗證明，這種方法能夠將胰腺癌、甚至是早期胰腺癌患者的血樣與胰腺炎和健康人的樣品靈敏的區分開來。同時，這種方法還能夠監測到不同治療效果的患者血液中EphA2-EVs水平的不同，說明這項技術也有可能用來監測癌癥治療的預后情況。

　　雖然目前這項技術利用光學顯微鏡作為信號監測方法，但是研究者正在發展全自動的儀器平臺，以使該技術能夠變得更加方便和高通量，便于在臨床機構推廣。胡教授已經有意將這項新的技術轉化為實際的臨床應用，當然，估計仍需要2-3年的時間來等待FDA的批準。

　　EVs的廣闊前景

　　不僅是胰腺癌，通過將納米粒子上的抗體更換為其他疾病的特異性探針，這項技術就能夠利用EVs檢測更加廣譜的疾病類型。

　　胡曄教授和同事已經在小規模的臨床研究中證實了這種方法可用于檢測肺結核樣本。在這項研究中，病人的尿液樣本中能夠檢測到豐富的結核菌分泌的EVs。這一激動人心的結果為非侵入性的結核病快速診斷開啟了新的大門。臨床上結核病的標準檢測樣本是病人的痰液，但是對于無法提供痰液樣本的病人，往往需要進行一項或多項侵入式的檢查。對于這些病人，一種非侵入式的新檢查手段具有非常重要的意義。

　　目前，與各種疾病相關的EVs應用研究正在加速進行。一些研究者甚至在探索EVs作為藥物載體或治療制劑的可能。曾經被認為是細胞垃圾的EVs，其潛在的生物醫學應用正變得越來越廣闊。