CRISPR實驗指南：如何檢測CRISPR脫靶突變（一）

　　張鋒實驗室的一位研究生：Winston Yan的項目就是利用CRISPR-Cas9基因組編輯系統的一個突變來敲除調控小鼠膽固醇的基因。“最終的目的是為治療應用鋪平道路，”Yan說，他最近完成了他的研究生工作，同時也第一次遇到CRISPR脫靶效應的問題。

　　CRISPR能幫助研究人員快速有效地對基因組進行有針對性的切割。它的特異性和易用性使其成為了頗具潛力的工具，可用于去除缺陷基因，治療遺傳疾病或癌癥，編輯作物的基因組增加其產量或抗病性等。

　　然而，研究人員也首先必須克服CRISPR的主要限制之一：不僅在其目標位置切割，而且在具有相似序列的非預期位置上也會進行切割。這些脫靶切割可能發生在整個基因組中，導致產生損害細胞功能或直接殺死細胞的有害突變。

　　要想研發檢測CRISPR脫靶突變的方法并不容易，但在過去幾年中，研究人員提出了各種新方法。The Scientist雜志最新介紹了這些方法。

　　計算機模擬預測與無偏差檢測

　　CRISPR編輯的特異性差異甚大，其精確性的一個關鍵在于導向RNA（gRNA），也就是指導Cas9核酸酶在基因組上特定位置切割的RNA序列。

　　“即使在同一個生物體內，這個導向RNA可以讓你完全不要考慮脫靶突變的問題，而另一個導向RNA可能會帶來多達150個脫靶點，”德國RWTH亞琛大學的博士研究生Julia Jansing說。

　　為此，研究人員發現或設計了比常用Cas9特異性更強的其他核酸酶，減少了非靶標位點的數量，比如Cpf1核酸酶和Cas9的高保真度版本。

　　但是，即使是優化后的導向RNA或核酸酶，也有可能導致基因組發生無意改變。預測CRISPR脫靶活動的一種方法，就是使用基于導向RNA序列鑒定可能的脫靶位點的計算算法，研究人員在基因組切割之后再進行靶向測序，檢查這些預測的脫靶位點突變。

　　每種算法都有自己的秘訣，其結果并不總是一致的。“預測工具有好有壞，你會得到不多不少的可靠性，”Jansing說。

　　目前尚未進行過生物信息學預測工具的系統性比較，因此研究人員只能根據他們的偏好性，或者是否支持他們研究的基因組來選擇一個。比如說，研究小鼠或人類的研究人員比從事番茄研究的有更多的工具可供選擇。

　　對于基礎研究應用，如制作突變細胞系，這種預測工具可能更為合適，因為它相對快速，簡單且便宜，而且通常足以準確分析脫靶突變不太多的情況，并且不會混淆對實驗結果的解釋。

　　但是這樣的預測遠非萬無一失。

　　“我們是把這種內在的偏差放在我們正在觀察的地方，因為我們假設我們了解Cas9是如何切割的，”Yan說， “但是從許多不同的研究來說，情況并非如此。”另外，計算預測可能過于寬泛。“你永遠不會在數千個站點上進行PCR來尋找少量的脫靶，”他補充道。

　　為了克服目前計算機預測的局限性，研究人員開發了多種體外和基于細胞的技術，全基因組范圍無偏差檢測CRISPR脫靶突變。這些方法在開發治療藥物，甚至在臨床前研究中至關重要，因為這些方法可以檢測罕見和不可預見的脫靶編輯，這些編輯可能會對患者產生潛在的有害影響，例如激活致癌基因。

　　哈佛大學醫學院病理學教授Keith Joung說：“監管機構可能會要求進行某種全基因組脫靶分析。”