質譜沙龍第三十三期活動報道

　　2011年9月25日，第三十三期質譜沙龍活動在北京大學分析測試中心成功舉行。來自第二炮兵總醫院、北京大學、中科院微生物研究所、中國醫學科學院基礎醫學研究所、空軍總醫院、AB SCIEX公司、北京艾米諾醫學研究有限公司等，近四十位專家、學者、技術工程師參加了本次沙龍活動，本次沙龍以大分子為主題，共同探討質譜技術及其在生物蛋白方面的前沿應用。

質譜沙龍活動現場

用電噴霧離子阱質譜及離子遷移質譜研究四鏈體DNA的形成、性質和與小分子的結合

　　北京大學分析測試中心周江老師作了題為《用電噴霧離子阱質譜及離子遷移質譜研究四鏈體DNA的形成、性質和與小分子的結合》的報告，主要介紹了電噴霧離子阱質譜觀測四鏈體的形成、構象變化、以及與小分子結合能力，并介紹了離子淌度質譜及其在四鏈體研究方面的應用。

北京大學分析測試中心 周江 老師

　　四鏈體的形成

　　周老師選擇的目標靶點是端粒，主要是抑制端粒酶，想在端粒末端的富集序列做些工作。所選擇的序列主要有以下一些：尖毛蟲和四膜蟲等原生動物的端粒序列，人類的端粒序列和c-myc序列。其中，在原生動物體中的端粒序列，X代表T、A、C三個堿基，形成四面體結構，4個G形成一個平面，中間的金屬離子起到配合作用，即形成了一個相對穩定的四鏈體結構，舉了半月形鏈狀分子和平面分子的例子。把Q2與Q3混合在一起，只有各自四鏈體的結構，沒有混合和自我雜交的結構，這個結果是沒有經過退火得到的。當把G鏈延長，發現了n-1規則，就是說G平面比那中間的陽離子是剛好是多一個，這在質譜上看是很明顯的，通過數字可以很精確地算出來，5個G的是4個NH₄⁺，7個G的是6個NH₄⁺，所以用質譜確定是個很迅速的過程。

　　四鏈體與小分子結合及其性質

　　四鏈體與小分子結合的強弱，跟位點有關，跟小分子結合的模式也是不太一樣的，相比較而言，結合程度Q2>Q1>Q3。對于穩定性，通過提升溫度而產生單鏈，單鏈與四鏈的比值發現：不加小分子，穩定性依次是Q2>Q1>Q3；加了小分子后，鏈狀的小分子使之提升了一點，而平面小分子使之顯著提升，而總體的穩定性順序是保持一致的。

　　周老師重點做的是人體端粒序列，這對人類抗癌有現實意義。在長的序列后面來設計一個分子開關，來控制穩定四鏈體結構。人類端粒序列有下面四種模式，一是反向平行模式有兩種，一是正向平行的模式，還有就是混合模式。在過程研究中，反向平行的在295有一個正峰，260有一個負峰，而正向平行在260有一個正峰。若只在水中，峰是雜亂無章的，而若加一點陽離子，峰立馬在質譜里就變得很漂亮，因此，陽離子對四鏈體的結構起到了穩定的作用。同樣是這個東西，加入小分子也可起到穩定的作用。在退火之前，加入平面小分子可以看到結合峰，退火之后就看不見了，這就說明小分子對四聯體的構象有一定的選擇性。接下來，周老師介紹了特異選擇性的例子，并在生物方面做了些實驗，驗證了這分子有一定的抗癌活性。

　　離子淌度質譜及其應用

　　周老師在UCSB做離子淌度是比較早的，當時還沒有商業化的離子淌度質譜。離子淌度腔(Drift Cell)是其重要組成部分，它只有幾個厘米，里面有環片電極并充滿氦氣，離子將受到兩個力的作用。在它前面是一個漏斗，后面是一個Quadrupole，最后是檢測。同時，它外面的腔是可以做升溫和變溫實驗的。離子在Drift Cell內受到的兩個力，一個力是往回拽，另一個力就是往前推，分子在里頭就會因此而分離，從而能夠區分5%以上的構象差異。

　　周老師所做的工作是關于四鏈體的，驗證退火的作用。退火之前是712，退火之后是752，這就說明退火之前以反向為主，退火之后正向增加了很多。在質譜里看到的三個峰，并不知道它具體有些什么變化，然后再拿這個峰來做離子淌度，可以得到一個分布。我們可以大膽地推測，其既有反向平行，又有正向平行，或者其它的構象，實際在計算中也是支持這個結果的。下面，周老師舉了一個與小分子結合的例子，在加入小分子后，正向平行向反向平行轉化。離子淌度質譜最大的優勢，在做A4結構的時候，因為它只有一條鏈，纏繞之后該是幾個電荷還是幾個電荷，同時沒有很明顯的加和峰。一條鏈的時候，有了離子淌度質譜，起碼可以知道構型發生了怎樣的變化，是否符合四鏈體的結構，并對構象變化作出準確的預測和判斷。

熱纖梭菌細胞壁蛋白質組及糖基化修飾研究

　　中國科學院微生物研究所羅元明老師作了題為《熱纖梭菌細胞壁蛋白質組及糖基化修飾研究》的報告，主要介紹了建立MALDI-TOF-TOF質譜研究糖蛋白的方法學，熱纖梭菌(C.thermocellum)細胞壁蛋白質組及糖基化修飾研究等內容。

中國科學院微生物研究所 羅元明 老師

　　利用RNase B建立MALDI-TOF-TOF研究糖基化的方法學

　　糖蛋白研究是相對比較難的，常見的糖基化連接方式有N-連接的和O-連接的。羅老師在研究細菌糖蛋白時，首先建立糖蛋白研究方法學。將糖蛋白樣品經一維膠或2DE分離，然后分別用胰蛋白酶切結合蛋白酶K、直接用蛋白酶K以及胰蛋白結合Pronase E等三種方法膠內酶切產生糖肽，并進行MALDI-TOF/TOF MS分析，從而建立糖蛋白快速鑒定方法。

　　熱纖梭菌細胞壁蛋白質組及糖基化研究

　　熱纖梭菌是嗜熱產芽孢的革蘭氏陽性厭氧菌，分泌多種纖維素降解酶，胞外組成纖維小體，胞外降解纖維素得到纖維糊精，進而產生乙醇和氫氣。為什么要做細胞壁糖蛋白研究呢？因為它可能和乙醇和氫氣的產生過程有關系。為此，羅老師采取了如下的技術路線。首先采用熒光燃料染色法及糖肽質譜分析法來確證蛋白樣品中是否有糖蛋白。常用的熒光染料是Pro-Q Emerald 488。其優點是特異性強，靈敏度高，能夠從全局角度提供糖蛋白存在的初步信息，成為目前糖蛋白檢測的常用方法之一。結果表明，經熒光染色及糖肽分析法確證細胞壁樣品中確實有糖蛋白存在。羅老師在初步實驗中選擇了胞外溶質結合蛋白和烯醇化酶進行進一步的糖基化位點及糖肽結構鑒定。經過MALDI-TOF-TOF MS/MS分析，發現有質量數相差162和203的系列碎片離子存在，表明這兩種蛋白為含Hex及HexNAc的糖蛋白。對于下一步工作，羅老師想進一步利用高分辨質譜及盡可能多的糖蛋白標準，建立較為完善的N-連接糖蛋白結構數據庫。

液質聯用質譜在臨床蛋白質組學研究中的應用

　　中國醫學科學院基礎醫學研究所孫偉老師作了題為《液質聯用質譜在臨床蛋白質組學研究中的應用》的報告，簡要介紹了他所在實驗室的儀器情況，主要介紹了蛋白質組學研究與分析。

中國醫學科學院基礎醫學研究所 孫偉 老師

　　孫老師所在的質譜中心前幾年購買了賽默飛世爾科技的液質聯用儀器，去年從AB SCIEX公司購買了TripleTOF 5600質譜系統，今年剛安裝完成。

　　尿蛋白質組學研究是孫老師在讀博士時做的，當時做體液蛋白質組學研究的人很多，而血液復雜度很高，所以，孫老師選擇了易取材、復雜度低，而又反映全身狀況的尿來做。最早做尿的是在97年，當時采用SPE(C18)-SCX-RP-ESI-MS方法，可以鑒定三十多個蛋白;到2001年才出現了真正意義上的尿蛋白質組學分析，使用RP-Q-TOF，能夠鑒定124個蛋白；2002年，分別采用丙酮沉淀、超速離心和2D-gel-MALDI-TOF方法，鑒定出47個蛋白;2004年，采用SEC-IASC-2DE-MALDI/ESI-MS方法，鑒定出150個蛋白。而孫老師采用1DE、1DLC/MS/MS和2DLC/MS/MS方法，共鑒定出226個蛋白，還鑒定出一些低分子量蛋白。隨著近年質譜儀器的不斷更新，鑒定的蛋白越來越多，一次實驗可鑒定出1500個蛋白。

　　接下來，孫老師介紹了Thermo的LTQ Velos Orbitrap儀器，BSA的檢測靈敏度可達到100amol， 一次2個小時的實驗即可鑒定出1500多個蛋白。另外，孫老師用該儀器做了妊娠糖尿病唾液蛋白質組分析，采用1DLC方法分別分析了GDM組和對照組，18種蛋白在2型糖尿病患者唾液中顯著升高，而且這些蛋白與胰島素抵抗或糖尿病血管并發癥有關。隨著儀器的進展，高分辨率的質譜儀將成為以后蛋白質組學研究的主要工具。

專題討論：質譜技術在生物大分子領域的應用

　　本次互動交流與專題討論的主題是：質譜技術在生物大分子領域的應用，由AB SCIEX公司李春波博士主持。

AB SCIEX公司 李春波 博士

　　應用于生物大分子領域的質譜技術主要有MALDI-TOF和ESI-MS兩方面，用于核酸和蛋白質的鑒定、定量和修飾研究。蛋白質組發展的趨勢，正在從發現蛋白質組邁向靶向蛋白質組。如何實現定向蛋白質組(MIDAS技術流程)?這就需要定向蛋白質研究核心技術QTRAP質譜。MRM究竟有哪些優點？檢測靈敏度比傳統的掃描模式高500-1000倍，特別適合低豐度蛋白的鑒定；定量的線性范圍寬，大于6個數量級（其它技術只有4個數量級左右），特別適合樣品含量有顯著差異的樣品分析；掃描速度快，結合Schedule MRM軟件，一次質譜掃描實驗可以完成上千對MRM，因此可以同時檢測幾百種蛋白質的含量變化；采用MRM方法定量已經成為小分子領域定量的黃金標準，技術成熟，使用簡便，在蛋白質組學中的應用現在正處于黃金時期，結合臨床樣本，容易出高檔次文章。定向蛋白質組可以解決定向定性蛋白質組學的單肽段蛋白質鑒定的確認，復雜樣本低豐度蛋白的檢測和靶向翻譯后修飾位點鑒定；還可解決定向定量蛋白質組學的生物標志物確認、定量，信號通路分析、翻譯后修飾的定量動態描述等問題。

AB SCIEX TripleTOF? 5600系統

　　AB SCIEX TripleTOF? 5600系統是最快、最靈敏的高分辨率質譜，能夠充分滿足高標準的定性和定量分析需要。一個平臺就能夠涵蓋蛋白質組學的定性和定量研究，創新源自AB在質譜定量領域的領導性技術創新。AB SCIEX TripleTOF? 5600系統具有高分辨率、高質量準確度、高靈敏度、高采集速度和高定量線性動態范圍，在MS和MS/MS，在定性和定量，總是同時到達。