病理學中的顯色原位雜交和FISH實驗

Tris-EDTA 溶液PBSDigest-All 3福爾馬林磷酸緩沖液二甲苯乙醇生物素和地高辛標記的DNA探針CAS-block (Zymed Laboratories)鏈霉親和素

石蠟切片烤箱微波爐染色缸熱循環儀潮濕烤箱

一、雜交前玻片處理

1.于 60°C 烤箱中烤片過夜。

2.在二甲苯中脫蠟 3 次，每次 15 min。

3.100% 乙醇脫水 3 次，每次 2 min，空氣干燥。

4.將盛有 Tris-EDTA 的塑料染色缸或其他用于微波爐盛水用的塑料容器，于微波爐中加熱至 199°F。

5.將玻片放人 Tris-EDTA 中，并繼續于微波爐中 199°F 加熱 15 min。

6.取出玻片，放在 PBS 中。

7.吸去玻片上多余的 PBS，然后放入 37°C 潮濕的玻片盒內（或其他潮濕的孵育盒內）。

8.在玻片上加 100~500uL Digest-All3, 依據組織類型和固定情況消化處理 10~30 min(見注釋 1)。

9.將玻片放入 PBS 中終止消化。

10.在 10% 福爾馬林緩沖液中固定 lmin，然后將玻片放在盛有 40 mLPBS 的染色缸中輕洗一下，去除福爾馬林。

11.室溫下，于 70%、85% 和 100% 乙醇中各 2 min 脫水，空氣干燥。

二、變性和雜交

1.將足夠的探針，如 10uL 加到組織切片上，適于 22 mmX22 mm 的蓋玻片范圍大小。

2.將蓋玻片蓋到切片上，用橡皮泥封邊。

3.將玻片放到熱循環儀的玻片槽內，于 94°C 變性玻片 3 min。

4.將玻片轉移到玻片盒內，將其放到潮濕的孵育箱中，于 37°C 過夜。

三、雜交后洗脫

1.依照每個染色缸內玻片的數量設置水浴的溫度，1 張玻片為 73°C，2 張 74°C，3 張 75°C，4 張 76°C。

2.將盛有 40 mL0.5XSSC 的染色缸放于水浴中，使缸內溫度與水浴溫度平衡。應在染色缸和內容物的溫度不低于室溫時，將其放入水浴。否則染色缸可能炸裂。用溫度計確定最終溫度。

3.從玻片上去除橡皮泥和蓋玻片。

4.在 0.5XSSC 中洗脫玻片 5 min。

5.將玻片轉移到室溫下盛有 40 mL 的 PBS/T 染色缸中。

四、檢測

FISH

1.去除玻片上多余的 PBS/T，將其放在潮濕的塑料玻片盒內。

2.將 100~500uL CAS-bl 〇 Ck 抗體稀釋液加到切片上，室溫孵育 lOmin。

3.輕輕蘸去 CAS-block，然后加 100~500uL 連接熒光的檢測試劑，如 1:500 稀釋的鏈霉親和素-Alexa594 和抗地高辛-焚光素。室溫孵育 30 min。

4.室溫下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脫 3 次，每次 2 min。

5.用 DAPI 封片介質復染玻片。

CISH

1.去除玻片上多余的 PBS/T，然后將其放到潮濕的塑料玻片盒中。

2.在切片上加 CAS-block，室溫下孵育 lOmin。

3.輕輕蘸去 CAS-block，加 HRP-鏈霉親和素，室溫下孵育 30 min。

4.室溫下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脫 3 次，每次 2 min。

5.依照操作說明書指南制備 DAB 底物，去除玻片上多余的 PBS/T，用 DAB 孵育玻片 15 min。

6.室溫下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脫 3 次，每次 2 min。

7.去除玻片上多余的 PBS/T，加抗地髙辛-熒光素（見注釋 2)，室溫下孵育 30 min.

8.室溫下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脫 3 次，每次 2 min。

9.去除玻片上多余的 PBS/T，加堿性磷酸酶抗熒光素，室溫下孵育 30 min。

10.室溫下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脫 3 次，每次 2 min。

11.依照操作說明書指南制備快紅底物，用 0.45pm 濾膜過濾。

12.流去/輕輕蘸去玻片上的 PBS/T，然后將快紅底物加到切片上，孵育 30 min，期間換兩次快紅底物，每隔 IOmin 換一次，即把玻片上的底物輕輕蘸去，再加上新過濾的底物。

13.室溫下，玻片在 40 mLPBS/T 中洗脫。

14.用蘇木素復染玻片，請小心不要過度染色（見注釋 3)。Gill’sformula(非有機溶劑—見注釋 4) 應與快紅聯合使用。

15.流水沖洗玻片數分鐘，不要用檸檬酸氨增強蘇木素的藍色。

16.在 50~75°C 烤箱或水浴中加熱甘油凝膠，滴一滴于切片上（不用有機溶劑），蓋上蓋玻片。輕壓蓋玻片以去除多余的甘油凝膠，如果甘油凝膠已經凝固，可以在熱板（37~45°C) 上加熱玻片。

注釋

1.殘余的細胞外和細胞內蛋白質可引起淡的紅-橙色之間的自發熒光，使 FISH 信號減弱，尤其當真的探針信號較弱時。通過增加石蠟切片的酶消化時間可以減小自發熒光。組織切片消化得不充分也將妨礙探針進入靶染色體區域（使「真」信號較弱），并且探針與非染色體細胞成分非特異的結合。因此，一般來講，如果細胞形態仍非常好（基于 DAPI 復染）并且細胞有散在的小的非特異性信號的話，消化時間應增加。適當雜交的石蠟切片應具有保存完好的細胞形態 (盡管不必非常好）、非常明顯的探針信號以及無非特異性信號。

2.此處的 CISH 檢測程序是通過后續的用熒光素抗地高辛和堿性磷酸酶抗熒光素孵育實現地高辛標記探針的擴增。然而，地高辛標記的探針也可以不用擴增步驟來檢測，此時則用堿性磷酸酶抗地高辛代替熒光素抗地高辛。

3.與雙色 FISH 的熒光素和羅丹明熒光相比，雙色 CISH 的不同顏色間的區別不明顯，當探針信號非常小的時候，辨別 DAB 與快紅尤為困難。然而，常常可以通過上下調節切片的焦距來辨別染色。在準確的聚焦點上，快紅或多或少有折射，紅色很明顯。蘇木素復染以能夠看見細胞核的最小量為宜，這也是很重要的。因此，蘇木素應該僅是淺藍色。否則，蘇木素將遮蓋與快紅顏色相區別的 DAB。

4.快紅染色后不能用有機溶劑封蓋玻片。盡管我們發現 CISH 玻片可以在室溫下存放約數月，但 FISH 和 CISH 玻片常規上還是保存于 4°C。存放時 FISH 信號將部分淬滅，而 CISH 信號大約可以穩定 2 年。

5.可以結合 CISH 和免疫組化染色，可以對雙色 CISH 程序稍做修改 (圖 1)。這種情況下，可分別通過單色 CISH 和免疫組化檢測一種染色體靶和一種蛋白質