細胞的環境、復制周期的狀態和分化狀態的改變會引起一些 mRNA 半衰期的改變。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | 細胞的環境、復制周期的狀態和分化狀態的改變會引起一些 mRNA 半衰期的改變。 |
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| 實驗材料 | DEPC細胞多聚核糖體RNA底物 |
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| 試劑、試劑盒 | 乙酸鉀乙酸鎂DTTTris-乙酸組織培養液無菌去離子水磷酸肌酸ATPGTP乙酸鉀精胺RNase 抑制劑 |
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| 儀器、耗材 | 高溫烤箱勻漿器研杵低速離心機超速離心機轉頭離心管單面刀片磁力攪拌器攪拌子 |
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| 實驗步驟 | 一、材料與設備
1. DEPC 處理玻璃器皿
(1) DEPC。
(2) 高溫烤箱。
2. 從指數生長的組織培養細胞制備多聚核糖體和多聚核糖體后上清 S130
(1) 指數生長期的組織培養細胞。
(2) 溶液 A : 1 mmol/L 乙酸鉀，2 mmol/L 乙酸鎂，2 mmol/L DTT，10 mmol/L Tris-乙酸（pH 7.6），室溫保存。
(3) 溶液 B : 添加了 30% ( m/V ) 無 RNase 蔗糖的溶液 A，消毒滅菌。
(4) 無血清和抗生素的組織培養液。
(5) 清潔的帶 Teflon 研杵的 Potte-Elvelijem 勻漿器，其槌管間隙（elearance）近 0.1 mm。
(6) 1 ml 或 2 ml Dounce 玻璃勻架器配緊型研杵，其槌管間隙 0.06 mm。
(7) 低速離心機、超速離心機及合適的轉頭和離心管。
(8) 單面刀片。
3. 從多聚核糖體制備 RSW
(1) 分離的多聚核糖體，步驟2 “從指數生長的組織培養細胞制備多聚梭核糖體和多聚核糖體后上清 S130”。
(2) 溶液 A、B 及超速離心機。
(3) DEPC。
(4) 磁力攪拌器和攪拌子。
(5) 4.0 mol/L 乙酸鉀。
4. 內源性多聚核糖體 mRNA 的降解
(1) 溶液 C : 200 μl 無菌去離子水，200 μl 1.0 mol/L 磷酸肌酸，40 μl 1 mol/L DTT，100 μl 0.2 mol/L ATP（Tris 鹽），20 μl 0.2 mol/L GTP ( Tris 鹽），1 ml 2.0 mol/L 乙酸鉀， 800 μl 2.5 mmol/L 精胺，200 μl 1.0 mol/L Tris-乙酸（pH 7.5 )。分裝為 0.2~0.4 ml，儲存 -70℃。
(2) 溶液 A 和濃度為每毫升 106 細胞的來源多聚核糖體。
(3) 溶液 D：1 μl 去離子無菌水，3.2 μl 溶液C，0.25 μl 4 mg/ml 肌酸激酶，0.25 μl 40 U/μl RNase 抑制劑。16 μl 溶液 A，0.2 μl 0.1 mol/L 乙酸鎂。用前于冰上配置，每個反應為 25 μl。
5. 用多聚核糖體作為 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解
(1) 溶液 A 和濃度為每毫升106 個細胞來源的多聚核糖體。
(2) 溶液 C 。
(3) 32P 標記（107cpm/μg，5000~20000 cpm/μl 水溶液）和未標記的 RNA 底物 ( 0.1~2.0 μg/μl 水溶液）。
(4) 溶液 E : 3.2 μl 溶液 C，0.25 μl 4 mg/ml 肌酸激酶，025 μl 40 U/μl RNase 抑制劑，16 μl 溶液 A，0.2 μl 0.1 mol/L 乙酸鎂和 1.1 μl RNA 底物，用前于冰上配置，每個反應 25 μl。
6. 用 RSW 作為 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解
(1) 溶液 A 同操作程序3 “從指數生長的組織培養細胞制備多聚核糖體后上清 S130” 中的步驟 (2)。
(2) RNA 底物同操作程序5 “用多聚核糖體作為 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解”。
(3) RSW（ribosomal salt wash）見操作程序3 “從多聚核糖體制備 RSW”。
(4) 溶液 F : 1.2 ml 無菌去離子水，200 μl 1.0 mol/L 磷酸肌酸，40 μl 1.0 mol/L DTT，100 μl 0.2 mol/L ATP ( Tris 鹽），20 μl 0.2 mol/L GTP ( Tris 鹽），800 μl 2.5 mmol/L 精胺，200 μl 1.0 mol/L Tris-乙酸（pH 7.5 )，0.2~0.4 ml 分裝，儲存于 -70℃。
(5) 溶液 G，每個反應 25 μl 用前于冰上配置：3.2 μl 溶液 F，0.25 μl 4 mg/ml 肌酸激酶，0. 25 μl KNase 抑制劑，15 μl 溶液A，0.2 μl 0.1 mol/L 乙酸鎂和 1.1 μl RNA 底物。
7. 用 mRNA 依賴的兔網織紅細胞翻譯系統作為 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解
(1) 微球菌核酸酶預處理的商品化兔網織紅細胞。
(2) 細胞來源或體外轉錄來源的 mRNA 溶解在無 RNase 無菌水中，濃度 0.1~5.0 μg/μl。
(3) 胎盤或重組的 RNase 抑制劑（40 U/μl）。
(4) 1 mmol/L 氨基酸混合物。
(5) 放射性標記的氨基酸（可選）。
二、操作程序
1. DEPC 處理玻璃器皿
(1) 在每一個玻璃器皿中加入少量的 DEPC 溶液。
(2) 轉動玻璃器皿使其所有的內表面都接觸到 DEPC。
(3) 倒掉 DEPC，用無菌的去離子水徹底沖洗直至明顯的 DEPC 味完全消除，至少要清洗 10 次。
(4) 用鋁箔覆蓋玻璃器皿，于烤箱烘烤至少 1 h，最好過夜。
2. 從指數生長組織培養細胞制備多聚核糖體和多聚核糖體后上清 S130
(1) 細胞計數。
(2) 于 4℃，500 r/min 離心 4 min，離心轉子的水平半徑為 8 cm。
(3) 吸棄上清。
(4) 用無血清與抗生素的組織培養液溫和地重懸細胞。
(5) 離心同步驟 (2)。
(6) 用溶液 A 重懸細胞。
(7) 將細胞轉移至預冷的 Potter-Elvehjcm 勻漿器中。
(5) 將勻漿器置于冰水浴中，快速上下移動并同時左右擰動研杵以研碎細胞。
(9) 將勻漿物以 8300 g 離心 10 min（相當于 9000 r/min），離心轉子的半徑為 9.1 cm。
(10) 小心地吸出上清（S8），避免帶出任何沉淀物（細胞核及膜），最后在離心管中剩下少量的上清以避免 S8 中污染有沉淀成分。
(11) 在預冷的超速離心管中加入約 25% 的溶液 B，將 S8 小心地鋪在溶液 B 上。如果 S8 上清的量不夠就加入溶液 A。
(12) 2℃，130000 g 離心 2.5 h。如果要收集 S130 上清的話，在離心結束后要求不開制動而自動減速。
(13) 回收蔗糖溶液上面的 S130 上清，應小心以防止收集到蔗糖溶液頂部的白色物質，如果必要的話，最后在離心管中剩下少量的上清不吸出。不用擔心離心管頂端的一些白色的黏稠液體是否會隨著 S130 一起被回收。將回收的 S130 保存在預冷的離心管中。
(14) 吸棄離心管中剩余的液體，包括蔗糖溶液。在管子的底部中央可見淡藍白色的多聚核糖體沉淀。
(15) 在冷室中用刀片在距離心管頂部近 2/3 的地方切開，棄頂部。
(16) 在余下的離心管底部溫和加入約 1 ml 溶液 A，輕輕來回移動管子洗去殘留液體包括蔗糖，吸棄液體。
(17) 審復清洗過程，此操作無須太快，因為多聚核糖體不會溶解在洗液中，但應小心緩慢的加入液體以避免使多聚核糖體沉淀從離心管底部脫離。
(18) 用小體積的溶液 A 重懸多聚核糖體沉淀，溶液 A 的體積依賴于多聚核糖體的量和后續的實驗需要，一般每 105 個細胞來源的多聚核糖體重懸在 1 μl 溶液中。
(19) 采用分光光度計以 260 nm 和 280 nm 波長檢測多聚核糖體和 S130 的光密度值， 分裝成 100~200 μl 并儲存于 -70℃。
(20) 可以取一小部分制備物回收 RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析制備的多聚核糖體的完整性。rRNA可以通過 EB 染色進行觀察，如果 28S rRNA 和 18S rRNA 帶清晰并且強度比接近 2：1（28S：18S），則表明 rRNA 是完整的。
3. 從多聚核糖體制備 RSW
(1) 如果可能的話，RSW 的制備應在冷室內進行。不必一定用新鮮制備的多聚核糖體，用凍存的多聚核糖體進行實驗也是可以的。用溶液 A 重懸多聚核糖體，其濃度應大于 105 細胞/μl，比較合適的起始濃度為 2X104~ 5X107 細胞/ml。
(2) 將多聚核糖體轉移到含有攪拌子的實驗管或燒杯中。攪拌子在使用前在 DEPC 中浸泡 3~5 min，然后用水完全漂冼凈。
(3) 滴加足夠的 4.0 mol/L 乙酸鉀，溫和攪動至其終濃度為 0.5 mol/L。
(4) 在冷室中溫和攪動 15 min，避免產生氣泡。
(5) 將溶液 B 加入同質異品聚合（polyallomer ) 超離心管中至其容積的 25% 左右，將鹽洗的多核糖體小心地鋪放在溶液 B 上，最終液面離管頂為幾毫米，2℃ 130000 g 超速離心 2.5 h。
(6) 回收蔗糖溶液層上的 RSW，將鹽洗的多聚核糖體沉淀保留在離心管中。
(7) 溫和地充分混勻 RSW 并測定其蛋白濃度。
(8) 將 RSW 分裝為 100~200 μl，儲存于 -70℃。
(9) 如果需要的話，離心管底部鹽洗的多聚核糖體可采用操作程序2 “從指數生長組織培養細胞制備多聚核糖體和多聚核糖體后上清S130 ”回收。
4. 內源性多聚核糖體 mRNA 的降解
(1) 將 21 μl 溶液 D 和 4 μl 多聚核糖體加入置于冰浴中的離心管內。
(2) 將管內的液體輕輕混勻并置于 37℃ 保溫，注意不要振蕩離心管。
(3) 溫育一定時間后將反應管保存于 -70℃ 或直接提取 RNA 進行分析。如果要分析不同時間點目的 mRNA 的降解情況，應將反應管從水浴中取出后直接置于干冰上，然后可以采用任何提取 RNA 的方法，但應避免非特異的 RNase 污染。
(4) 分析并定量內源性目的 mRNA。
5. 用多聚核糖體作為 mRNase 活性源來分析外源 mRNA 的降解
(1) 取 21 μl 溶液 E 和 4 μl 多聚核糖體加入置于冰浴的離心管內。
(2) 將反應管于合適的溫度下孵育一定的時間。
(3) 溫育一定時間后將反應管保存于 -70℃ 或直接提取 RNA 進行分析。如果要分析不同時間點目的 mRNA 的降解情況，應將反應管從水浴中取出后直接置于干冰上，然后可以釆用任何提取 RNA 的方法，但應避免非特異的 RNase 污染。
(4) 分析并定量內源性目的 mRNA。
6. 用 RSW 作為 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解
(1) 取 20 μl 溶液 G 和 5 μl RSW 加入冰浴的離心管中。
(2) 將反應管于合適的溫度下孵育一定的時間。
(3) 溫育一定時間后將反應管保存于 -70°C 或直接提取 RNA 進行分析。如果要分析不同時間點目的 mRNA 的降解情況，應將反應管從水浴中取出后直接置于干冰上，然后可以采用任何提取 RNA 的方疼，但應避免非特異的 RNase 污染。
(4) 分析并定量內源性目的 mRNA。
7. 用 mRNA 依賴的兔網織紅細胞翻譯系統作為 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解
(1) 依次在置于冰浴中的離心管內加入 35 μl 經核酸酶處理的裂解物，1 μl RNase 抑制劑、1 μl 氨基酸混合物、放射性冋位素標記的氨基酸和 mRNA 水溶液，加水至總體積為 50 μl。
(2) 輕輕混勻，并置 30℃ 反應一定的時間。
(3) 將反應產物儲存于 -70℃ 或立即提取 RNA。 |
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