水稻幼苗或其它禾木科植物提取

實驗概要

本實驗以水稻幼苗(禾本科)、李(蘋果)葉子為材料，學習基因組DNA提取的一般方法。

實驗原理

基因組DNA的提取通常用于構建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長的特性，可以將其與細胞器或質粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中，可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達到提取的目的。在提取過程中，染色體會發生機械斷裂，產生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時應盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩，以保證得到較長的DNA。一般來說，構建基因組文庫，初始DNA長度必須在100kb以上，否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進行RFLP和PCR分析，DNA長度可短至50kb，在該長度以上，可保證酶切后產生RFLP片段(20kb以下)，并可保證包含PCR所擴增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;   不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法，以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質對隨后的酶切、PCR反應等有較強的抑制作用，因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA時，應考慮除去多糖和酚類物質。

主要試劑

1. 提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。

2. 提取緩沖液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。

3. 80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

4. RnaseA母液

5. 其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

主要設備

1. 移液器

2. 冷凍高速離心機

3. 臺式高速離心機

4. 水浴鍋

5. 陶瓷研缽

6. 50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管

7. 彎成鉤狀的小玻棒

實驗材料

水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。

實驗步驟

1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ，60℃水浴預熱。

2. 水稻幼苗或葉子5-10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30-60分鐘(時間長，DNA產量高)，不時搖動。

3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘，使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。

4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。

5. 仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉淀。

6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團，在干凈吸水紙上吸干，轉入含TE的離心管中，DNA很快溶解于TE。

7. 如DNA不形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5分鐘，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。

8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。

9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃ 10分鐘，除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。

10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20分鐘左右，DNA形成絮狀沉淀。

11. 用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。

12. 將DNA重溶解于1ml TE，-20貯存。

13. 取2μl DNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質量。

注意事項

5g樣品可保證獲得500μg DNA，足供RFLP、PCR等分析之用。