酵母蛋白質和RNA的制備（稀堿法）

發布時間：2019-04-19 07:14 原文鏈接：酵母蛋白質和RNA的制備（稀堿法）

實驗概要

本實驗介紹了從酵母中分離制備蛋白質和 RNA 的原理和方法。

實驗原理

酵母細胞富含蛋白質和核酸。用稀堿液（0.2% 的氫氧化鈉）處理酵母使細胞裂解，離心收集上清液，得到酵母核蛋白抽提液。用鹽酸調節抽提液 pH 至 3.0 （核蛋白的等電點），核蛋白溶解度下降大量沉出，離心收集沉淀物為酵母蛋白質粗制品。

酵母核蛋白是一種結合蛋白質，是蛋白質與核酸的復合物。酵母核酸主要是 RNA （含量為干菌體的 2.67 ％-10.0 ％）， DNA 含量較少，僅為 0.03％ -0.516％。如設法使酵母核蛋自中的蛋白質與核酸分離并除去蛋白質和 DNA ，就可得到較純的 RNA 制品。這可通過以下操作完成：將核蛋自制品溶于含有 SDS 的緩沖液中，加等體積的水飽和酚，劇烈振蕩后離心，溶液分成兩層，上層為水相含有 RNA，下層為酚相，變性蛋白及 DNA 存在于酚相及兩相界面處。吸出水相并加乙醇即可沉淀出酵母 RNA。若用氯仿-異戊醇進一步處理 RNA 制品，可獲得純度更高的 RNA。

主要試劑

1. 0.2％ NaOH 溶液

2. 6 mol/LHCl 溶液

3. 95％乙醇

4. SDS-緩沖液：0.3% SDS，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/l 乙酸鈉，用乙酸調到 pH5.0

5. 飽和酚液：重蒸苯酚用4溶液飽和

6. 氯仿一異戊醇液：24 ：1(V/V)

7. 含2%乙酸鉀的95％乙醇溶液

8. 無水乙醇

9. 乙醚

主要設備

1. 離心機

2. 干燥箱

3. 恒溫水浴

4. 真空千燥器

5. 天平

6. 751 型分光光度計

7. 冰箱

8. 量筒（50ml）

9. 蒸發皿

10. Eppendorf 管（1.5 ml）

11. 燒杯（50m1，100ml）

實驗材料

鮮酵母或干酵母粉，pH0.5一5.0的精密試紙。

實驗步驟

1. 酵母核蛋白的提取

稱取鮮酵母 30g 或干酵母粉 5g, 倒入 100ml 的燒杯中。加入 40ml 0.2%NaOH 溶液，在 20-40℃水浴上攪拌提取 30-60min 后 4000r/min 下離心 10min, 取上清液于 50ml 的燒杯中，并置于放有冰塊的 250ml 燒杯中冷卻，待冷至 10℃以下時，用 6mol/L HCl 小心地調節溶液的 pH 至 3.0 左右。隨著 pH 下降，溶液中白色沉淀逐漸增加，到等電點時沉淀最多（注意嚴格控制 pH ）。 pH 調好后繼續于冰水中靜置 l0min ，使沉淀充分，顆粒變大。將此懸浮液以 3000r/min 離心 20min ，倒掉上層清液。將沉淀物轉入蒸發皿內，放入真空干燥器或干燥箱中干燥之后稱重，這就是酵母核蛋白粗品。

2. 苯酚法提取酵母 RNA

取上述核蛋白研碎，加 10ml SDS-緩沖液使成勻漿，洗入各 Rppendorf 管（略少于管容積的一半），室溫靜置 10min ，再加等體積的飽和酚液，室溫下劇烈振蕩 5min 后置冰浴中分層， 4000r/min 離心 10min ，吸出上層清液，轉入新的 Eppendorf 管，加 2 倍體積 95％乙醇（含2％乙酸鉀），在冰浴中放置 30min ，使 RNA 沉淀。再以 10 000r/min 離心 5min ，棄上清液，沉淀用少許無水乙醇和乙醚各洗一次，迅速離心各 lmin ，保留沉淀。傾去乙醚后，減壓真空干燥，準確稱重，記錄。
3. 結果處理

1) 計算核蛋白提取率