WesternBlot詳解－常見的問題指南（一）

 實驗常見的問題指南
根據問題的類型主要分成以下幾類（以下資料權作參考，請勿盲目模仿！）：

1. 參考書推薦

A. 對初學者看什么資料比較好？
解答：《抗體技術實驗指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）兩本書不錯。

2. 針對樣品的常見問題

B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡寫成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
解答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

C.細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？  解答：一般5×10^6就足夠了

D.同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？  解答：能，沒有問題，我們做過。

E. 同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
解答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

F. 如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

G. 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，多加5－10％甲醇。

H. 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？
解答：260kd的蛋白不好做， 分離膠用6％， Stacking Gel 3.5％。

I. 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。
解答：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb。

J. 蛋白變性后可以存放多久？
解答：－80℃，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。

K. 我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因為105ＫＤ的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意條帶位置。

L. 接下來我準備采用DAB顯色技術，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？ 
解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點．

M. 還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？
解答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結果不容易。

N. 做組織樣品的western的時候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點？
解答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制劑cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體，使用ＢＳＡ也是不錯的選擇。

O. 您是否可以介紹一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）。

P. 有什么方法可以提高上樣量？
解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量。

Q. 我要檢測的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速離心機，有沒有直接用低溫高速離心機就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞漿蛋白，用這個做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的轉移方法實施。

R. 蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？
解答：上樣量要根據實驗的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等， 如果只是要定性，則沒有太大的關系， 盡量多上就行了， 但是不要超過0.3μg/mm2。

S. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

3. 抗體

T. 做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
解答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。

U. 同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預試，怕費時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉膜過夜，一抗孵育也是過夜的，若封閉也過夜的話就要四天才看的到結果了。
解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你實驗摸索。我覺得轉膜過夜好像沒有必要吧，轉膜的目的也就是將蛋白轉到膜上就行啦，何必浪費時間呢。至于具體的轉膜時間，還要看你的目的蛋白分子量的大小；轉膜的設備，是半干式，還是濕式。一抗當然可以過夜，如果你想所短Western Blot時間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實驗室一般37度，兩小時就足夠了；你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時，多洗幾次，最好是在封閉；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點心吧，這樣不會浪費你的時間，只會節省你的時間！

V. 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
解答：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。（限于單抗）

W. Western Blot 中抗體的重復應用問題
解答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融。