氨基酸的檢測方法

　　迄今為止,自然界中已發現180多種氨基酸,其中參與蛋白質合成的氨基酸只有20多種,稱為基本氨基酸。氨基酸主要有兩種存在形式,一種是以游離態存在于生理體液(血漿、尿)、食品(酒、飲料)中,另一種是以結合態存在于肽和蛋白質中。由于氨基酸分析在蛋白質化學、生物化學、食品科學、臨床醫學等領域的研究中起著重要的作用,因此,對氨基酸分析方法的研究與改進得到人們高度重視。1958年, Spackman等[ 1 ]首先提出了用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結合的方法分析蛋白質中的氨基酸,實現了氨基酸分析的自動化。其后,人們不斷地發展新的氨基酸分析方法,柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜2積分脈沖安培檢測法等相繼應用于氨基酸分析。現已是多種氨基酸分析方法并存、互補。本文就目前應用于氨基酸分析的主要方法作一綜述。

　　2柱后衍生高效陽離子交換色譜法

　　高效陽離子交換色譜(HPCEC) 2柱后茚三酮衍生光度檢測分離測定氨基酸是一種經典的氨基酸分析方法。此方法是利用氨基酸在酸性條件下形成陽離子而在陽離子交換柱中分離,分離后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可見光度檢測器檢測。采用陽離子交換色譜分離、柱后茚三酮衍生光度檢測技術的商品化的自動氨基酸分析儀在20世紀60年代初問世。現在的自動氨基酸分析儀已實現了程控自動化和數據處理電腦化,分析時間已縮短至1 h以內。

　　目前,專用氨基酸分析儀的色譜柱主要是以磺酸型強酸性陽離子交換樹脂為柱填料。該樹脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成,球狀樹脂的粒度一般在5～10μm之間,交聯度多為8%～12%。流動相一般采用3～5種不同pH值的緩沖液(檸檬酸鈉或檸檬酸鋰等)。氨基酸的分離不僅受離子交換樹脂的型號、交聯度和粒度的影響,還受柱溫、洗脫緩沖液的陽離子類型、pH、離子強度、淋洗梯度、流速以及其中有機溶劑含量的影響。

　　由于大多數氨基酸在紫外可見光區無吸收,因此必須將其衍生、轉化為具有紫外可見吸收或能產生熒光的物質才能檢測。茚三酮是最常用的柱后衍生化試劑。采用茚三酮作柱后衍生試劑的方法被認為是這一技術的標準方法(AOAC采用的氨基酸分析標準方法)。這種方法的優點是準確、可靠、重現性好,能測定大量氨基酸及其同系物。方法的不足是靈敏度不高,只可對100 pmol以上的氨基酸進行準確分析,而且需要雙波長檢測,在440 nm處檢測脯氨酸,在570 nm處檢測其它氨基酸[ 2 ]。為了提高分析靈敏度,用熒光胺代替茚三酮作柱后衍生試劑,采用熒光檢測,可檢測幾個pmol的氨基酸[ 3 ]。熒光胺與氨反應的靈敏度比茚三酮與氨反應的靈敏度大約提高了3個數量級。這樣,測定中受氨干擾程度較小。但熒光胺不能直接與脯氨酸反應,需通過氧化打開脯氨酸的咪唑環才能衍生[ 4 ]。

　　在柱后衍生熒光檢測中,鄰苯二甲醛(OPA )比熒光胺更常用,檢出限一般可達5～10 pmol[ 5 ] ,但需從樣品譜圖中扣除OPA的本底吸收[ 6 ]。OPA不能直接同脯氨酸反應,需將后者氧化開環后方可衍生。柱后衍生高效陽離子交換色譜法可應用于蛋白質水解液、生理體液、食品等樣品中氨基酸的測定。但色譜儀器較復雜,需要通過泵和反應器以保證洗脫液與柱后衍生試劑均勻混合,使儀器局限于一類分析。

　　3柱前衍生反相高效液相色譜法

　　近20年來,柱前衍生反相高效液相色譜法(RP2HPLC)分析氨基酸得到了迅速發展,逐漸取代柱后衍生HPCEC在許多領域中的應用。RP2HPLC分析方法更加靈敏、快速。而且,與局限于氨基酸分析的自動分析儀不同, HPLC儀適用性極廣。

　　RP2HPLC要求將氨基酸在柱前轉化為適于反相色譜分離并能被靈敏檢測的衍生物。柱前衍生的關鍵在于衍生試劑的選擇。選擇衍生試劑的標準是能與各氨基酸定量反應,每種氨基酸只生成一種化合物且產物有一定的穩定性,不產生或易于排除干擾物;操作簡單,色譜分離分辨率高,檢測靈敏度高,分析時間短,便于實現自動化和使產物能在不同型號的高效液相色譜儀上測定。一些比較常用的柱前衍生試劑列于表1。主要的柱前衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA ) [ 7～11 ]、異硫氰酸苯酯( P ITC) [ 12～18 ]、氯甲酸芴甲酯( FMOC2Cl) [ 19～25 ]及丹酰氯(Dansyl2Cl) [ 26～29 ]。

　　在還原劑(β2巰基乙醇或32巰基丙酸)存在下, OPA與一級氨基酸發生衍生反應,衍生物在RP2HPLC柱上分離,根據衍生物熒光特性檢測。此方法在儀器自動化方面是可行的。采用OPA衍生方法可在13 m in內,在亞pmol水平,分離測定23種主要生理氨基酸[ 10 ]。OPA衍生法具有樣品制備簡單、衍生反應迅速、靈敏度高及易于實現自動化操作等優點。此方法的缺點是不能檢測仲氨基酸及衍生物不夠穩定。后者可通過在線自動衍生分析來克服。用P ITC作柱前衍生試劑的氨基酸分析得到了廣泛應用。氨基酸與P ITC反應生成苯氨基硫甲酰衍生物( PTC)。衍生物單一、穩定,衍生反應速度快。

　　這種衍生物經RP2HPLC分離后,用紫外檢測( 254nm)。檢出限大約是1 pmol。一、二級氨基酸均可被測定。P ITC衍生法在儀器自動化方面也是可行的。此方法已拓展至含磷氨基酸[ 17 ]和含硫氨基酸[ 18 ]等修飾氨基酸的分析。FMOC2Cl衍生法亦是一種常用的柱前衍生法,而且在儀器自動化方面也是可行的。FMOC2Cl可與一級和二級氨基酸生成穩定的衍生物。熒光檢測靈敏度可達fmol水平。此方法的缺點是需要將反應過程中剩余的衍生試劑萃取出以中止衍生反應,同時避免衍生物的分解。另外, FMOC2Cl與組氨酸形成單、雙衍生物的比例不穩定,影響定量。Dansyl2Cl與包括亞氨基在內的所有氨基酸均起反應,與組氨第3期于泓等:氨基酸分析方法的研究進展993酸形成多種衍生物,與賴氨酸、酪氨酸、胱氨酸形成雙丹酰衍生物,與其他氨基酸則形成單丹酰衍生物[ 28 ]。此方法對胱氨酸的線性特別好[ 29 ]。一些柱前衍生方法的主要特點總結于表2。作為柱前衍生試劑, Dansyl2Cl、FDNB、FDNPAA和FDNDEA衍生法的缺點是衍生后生成干擾副產物,并且后3種方法需要通過抽干的方法除去反應劑。

　　FMOC2Cl法的缺點是,為停止衍生反應和防止生成的衍生物自發水解,過量的反應劑必須用戌烷萃取除去[ 23 ]。由于以上幾種方法的不足,只有OPA和P ITC被廣泛用作柱前反應試劑。衍生后的氨基酸一般在鍵合C18柱上,根據液液分配原理進行分離。流動相多以乙酸鹽或磷酸鹽緩沖液為主,以乙腈、甲醇或四氫氟喃為調節劑。由于氨基酸衍生物仍保留著兩性化合物的特點,故除改變調節劑之外,還可通過調節緩沖液pH值、離子強度、柱溫等使之達到理想的分離。當然,不同衍生物所選用的柱型、流動相以及氨基酸的洗脫時間和順序不盡相同。柱前衍生反相高效液相色譜法可用于分析蛋白質水解液、生理體液和食品等樣品中的氨基酸。

　　4高效陰離子交換色譜

   積分脈沖安培檢測法(HPAEC2IPAD )是一種新的氨基酸分析方法。此方法是基于氨基酸分子中的羧基在強堿性介質中可以形成陰離子,而氨基酸分子中的氨基在強堿性介質中通過施加一定的電位,可在貴金屬(金、鉑)電極表面發生氧化反應,從而實現氨基酸的陰離子交換色譜分離和積分脈沖安培檢測。1983年, Polta等[ 41 ]首先提出了用陰離子交換色譜2脈沖安培檢測法分析氨基酸。其后,W elch等[ 42 ]對脈沖安培檢測氨基酸和積分脈沖安培檢測氨基酸進行了比較研究,提出了檢測氨基酸的積分脈沖安培檢測波形。以上研究工作雖然實現了氨基酸的直接分離檢測,但由于存在基線漂移、線性、重現性差、電極損耗大以及無高效陰離子色譜柱分離氨基酸等問題,因此未能使氨基酸的分析達到可應用程度。Clarke等[ 43 ]得到了檢測氨基酸的優化波形,采用高效陰離子交換柱,成功地實現了氨基酸的高效陰離子交換色譜分離和積分脈沖安培檢測,并將此方法應用于蛋白質水解產物分析。HPAEC2IPAD分析氨基酸不需要對氨基酸進行衍生化處理,可直接進行分離、檢測,對氨基酸的檢出限為pmol～fmol級。由于糖類化合物(含有多羥基)在強堿性介質中可以形成陰離子并可用脈沖安培法檢測,因此,用HPAEC2IPAD亦可分析糖類化合物、氨基糖和糖酸等。Yu等[ 44 ]對影響氨基酸分離和檢測的因素進行了詳細研究。這些因素包括淋洗液濃度、柱溫和檢測波形。通過實驗得到了分離和檢測19種氨基酸的最佳條件,并將這一條件應用于纈氨酸產品中微量氨基酸雜質的測定。Jandik等[ 45 ]采用二模式積分脈沖安培檢測(即兩種積分脈沖安培檢測波形) ,對氨基酸和糖類化合物的混合物進行了分析。糖類化合物的檢測電位比氨基酸的檢測電位低,在較高的電位下,氨基酸和糖類化合物均被檢測,而在較低的積分電位下只檢測糖類化合物,氨基酸(羥基氨基酸除外)不被檢測或檢測信號很弱。這樣,對氨基酸和糖類化合物的混合物可選擇性地檢測糖類化合物。這種二模式積分脈沖安培檢測方法可用于氨基酸和糖的鑒定。

　　Yu等[ 46～48 ]詳細研究了氨基酸和糖類化合物在陰離子交換柱中的保留行為和積分脈沖安培檢測行為,提出了一次進樣同時分析氨基酸和糖類化合物的方法,并將方法應用于液體調味品、黃酒和氨基酸注射液中氨基酸和糖類化合物的測定。D ing等[ 49 ]研究了綠茶中氨基酸和糖的分離測定,提出了一個改進的梯度淋洗程序,從而實現了綠茶中茶氨酸與谷氨酰胺的分離,并且葡萄糖、果糖和蔗糖先于中性氨基酸洗脫,避免了相互干擾。

　　由于糖類化合物亦可用HPAEC2IPAD分離和檢測,因此,大量糖類化合物的存在對氨基酸的測定有時會產生干擾。對于測定含有大量糖類化合物樣品中的氨基酸, Jandik等[ 50 ]提出了一種簡單的在線除糖測定氨基酸的方法。首先將樣品通過一個短的氫型陽離子交換柱(捕獲柱) ,由于在酸性條件下糖類化合物是以分子形式存在,而氨基酸以陽離子形式存在,因此,糖類化合物不被捕獲柱保留,而氨基酸被捕獲柱保留。其后,保留有氨基酸的捕獲柱被切換到分析流路中與分離柱相連,流動相將捕獲柱中的氨基酸帶入分析柱,這樣,在排除了糖干擾的情況下完成分離,并用于胡羅卜汁樣品中氨基酸的測定。D ing等[ 51 ]提出了離線除糖測定氨基酸的方法。

　　首先將樣品中的糖通過氫型陽離子交換柱除去,然后測定氨基酸,并應用于果酒樣品中氨基酸的測定,得到滿意結果。與在線除糖方法相比,離線除糖方法的容量高,更適于含糖量高的樣品中氨基酸的測定。用HPAEC2IPAD分離測定氨基酸時,精氨酸的保留時間很短,接近于死時間,這樣影響了精氨酸的準確定量。為了增加精氨酸在陰離子交換柱中的保留時間, Jandik等[ 52 ]提出了通過閥切換方法將樣品與硫酸同時進樣,這樣可利用陰離子交換柱中殘存的陽離子交換基團增加精氨酸的保留。

　　此項技術已用于大豆水解液和細胞培養基樣品的分析。高效陽離子交換色譜2積分脈沖安培檢測法亦可用于氨基酸的分析。Jandik等[ 53 ]用此方法測定了血漿中的高半胱氨酸和甲硫氨酸,所用工作電極為鉑,流動相為0. 15 mol/L高氯酸鈉、0. 02 mol/L高氯酸和5%乙腈。用積分脈沖安培法檢測氨基酸時,存在金工作電極污染問題,而且尚無有效的清洗方法。為克服金電極的污染, Cheng等[ 54 ]研制了“可拋棄”金電極,用此電極分析氨基酸的結果與普通金電極一致。高效陰離子交換色譜2積分脈沖安培法可用于蛋白質水解液、食品、飼料等樣品中氨基酸的測定。常用的蛋白質水解方法可與之相匹配。3種色譜法分析氨基酸的比較見表3。

　　5其它分析技術

　　有許多關于毛細管電泳技術(CE)分析氨基酸的報道[ 55～57 ]。此方法適合于氨基酸的手性分離。兩第3期于泓等:氨基酸分析方法的研究進展104種CE模式用于氨基酸的分析。一種是毛細管區域電泳( CZE) ,另一種是膠束電動毛細管色譜(MECC)。與HPLC相比, CE的優點是分離效率高,無須梯度洗脫,分析速度快,溶劑消耗少。然而, CE分析的重現性較差。Sm ith[ 58, 59 ]總結了CE分析氨基酸的進展。柱前、柱上和柱后衍生技術,紫外、熒光、電化學、質譜等檢測技術,均被用于分析氨基酸。在柱前衍生RP2HPLC分析氨基酸中所用的衍生試劑多數亦適用于CE法。氨基酸存在手性異構體(D型氨基酸和L型氨基酸) , CE是目前用于氨基酸手性分離報道較多的方法。W an等[ 60 ]對CE用于氨基酸的手性分離做了詳細評述。氨基酸的手性拆分主要分為直接拆分和間接拆分兩種方式。直接拆分是在加入手性選擇性試劑的背景電解質溶液中分離氨基酸對映體,手性選擇性試劑主要有環糊精類化合物、抗生素和表面活性劑等。間接拆分是利用手性衍生試劑將手性氨基酸轉變為具有不同化學性質的衍生物,即手性消除,然后在非手性條件下進行分離。隨著CE技術的發展,其在氨基酸及其手性異構體分析方面將起重要作用。

　　氣相色譜( GC)用于測定衍生的氨基酸已有較長時間[ 61 ]。此方法的優點是分離時間短、柱效高及易與質譜聯用;缺點是衍生反應干擾多、專一性差。目前此方法在氨基酸分析中應用不多。Gehrke等[ 62 ]比較了氣相色譜與柱后衍生高效陽離子交換色譜分析氨基酸,發現二者的結果是相近的。Husek等[ 63 ]報道了用GC同時分析血漿中的20種氨基酸和30種非氨基有機酸,樣品制備時間不足30 m in。GC/MS是一種強有力的分析方法,可測定氨基酸異構體[ 64 ]。

　　高效液相色譜/質譜(HPLC /MS)和毛細管電泳/質譜(CE /MS)分析氨基酸是一種新趨勢。Schmeer等[ 65 ]用液相色譜/大氣壓離子化質譜(LC /AP I2 MS)測定了D /L 2胱氨酸和半胱氨酸的PTC衍生物,得到了17種PTC2氨基酸和6種PTC2胱(半胱)氨酸的碎片。Ma等[ 66 ]用LC /AP I2 MS測定了鼠腦中的谷氨酸和γ2氨基丁酸。Pramanik等[ 67 ]用熱噴霧LC /MS分析了氨基酸的PTC衍生物。Kwon等[ 68 ]用高效液相色譜/大氣壓微波等離子體離子化質譜(HPLC /AP2 M IP I2 MS)測定了非衍生化氨基酸。Qu等[ 69 ]用離子對反相液相色譜/同位素稀釋串聯質譜測定了人血液中的非衍生化氨基酸。王宗義等[ 70 ]用液相色譜/電噴霧離子化質譜(LC /ESI2 MS)分離鑒定了碘化酪蛋白水解產物中的碘化氨基酸。He[ 71 ]、Soga[ 72 ]、Schultz[ 73 ]等用毛細管電泳/電噴霧離子化質譜(CE /ESI2 MS)分析了非衍生化氨基酸。