CreloxP基因重組技術

re-loxP 是一種位點特異的基因重組技術，被廣泛應用于特異位點的基因敲除、基因插入、基因翻轉和基因易位，在真核生物和原核生物中均有廣泛應用。

Cre-loxP 的基本原理

Cre 蛋白是一種重組酶，是causes recombination的縮寫，于1981 年從 P1 噬菌體中被發現，屬于 λInt 酶超基因家族。Cre 重組酶基因編碼區序列全長1029bp（EMBL 數據庫登錄號為 X03453），編碼 38kDa 蛋白質，Cre 重組酶是由 343 個氨基酸組成的單體蛋白。LoxP 位點，是 locus of X-over P1的縮寫，是位于 P1 噬菌體中的 34bp 序列，由兩個 13bp 的反向回文序列和 8bp 的中間間隔序列共同組成，間隔序列決定 loxP 的方向，loxP 位點的序列如下所示：

13bp         8bp           13bp
ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT

Cre 重組酶不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的 DNA 序列，即 loxP 位點，使兩個 loxP 位點間發生基因重組。Cre 重組酶無需借助任何輔助因子，可作用于多種結構的 DNA 底物，如線形、環狀甚至超螺旋 DNA。

Cre-loxP 誘導基因重組的幾種方式

當細胞基因組內存在兩個 loxP 位點時，一旦有 Cre 重組酶出現，就會誘導兩個  loxP 位點間的序列發生重組。首先，Cre 重組酶結合到兩個 13bp 的回文序列形成二聚體，然后這個二聚體和另外一個 loxP 位點上的二聚體結合，形成四聚體。LoxP 位點是有方向的，形成四聚體的兩個 loxP 位點是平行的，隨后這兩個 loxP 位點間的雙鏈 DNA 被 Cre 重組酶切掉，然后切口在 DNA 連接酶的作用下重新連接。重組的結果取決于兩個 loxP 位點的方向，主要有以下幾種可能：

1.如果兩個 loxP 位點位于一條 DNA 鏈上，且方向相同，Cre 重組酶能有效敲除兩個 loxP 位點間的序列（圖1A）；

2.如果兩個 loxP 位點位于一條 DNA 鏈上，但方向相反，Cre 重組酶能導致兩個 loxP 位點間的序列翻轉（圖1B）；

3.如果兩個 loxP 位點分別位于兩條不同的 DNA 鏈或染色體上，Cre 酶能介導兩條 DNA 鏈的交換或染色體易位（圖1C）。

Cre-loxP 系統的優點

在當今世界上，Cre-loxP 系統是在神經系統中應用最廣泛的條件性基因敲除工具，主要是因為該系統有如下優點：

圖1. Cre-loxP誘導基因重組的方式，敲除（A）、翻轉（B）、易位（C）

1. 高效性：Cre重組酶與具有loxP位點的DNA片段形成復合物之后，可以提供足夠的能力引發之后的DNA重組過程，重組過程簡約高效；

2. 特異性強：loxP位點是一段含回文序列結構和中間有間隔的34bp元件，這種結構保證了loxP序列的唯一性，從而保證基因重組的特異性很強；

3. 可應用范圍廣：Cre重組酶是一種比較穩定的蛋白質，可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發揮作用，所以說Cre-loxP系統的可應用范圍非常廣；

4. 可由二型啟動子啟動表達：Cre重組酶的編碼基因可由任何一種二型啟動子驅動，由此保證Cre重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官或者在不同的發育階段或不同的勝利條件下表達，從而實現較高的組織和細胞特異性。

Cre-loxP系統的操作方式

1.  轉基因動物依賴的基因重組

一般情況下，科學家們利用Cre-loxP系統進行基因操作時，會采用兩種轉基因動物進行雜交，即一種帶Cre的轉基因動物和一種帶loxP序列的轉基因動物進行交配，使得后代既帶Cre又帶loxP基因，然后Cre重組酶會識別loxP位點，導致基因重組（圖2）。由于Cre基因的表達受上游啟動子的調控，這樣啟動子的時空特異性就決定了基因重組的時空特異性。雖然該方法可以實現高效、特異的基因重組，但是以下不足限制了用轉基因動物進行基因操作的發展：

1)   轉基因動物的難以獲得：目前雖然已經有一些Cre和loxP轉基因動物，但是要獲得這些轉基因小鼠比較困難，特別是對于國內的科研工作者來說。而且還有很多Cre和loxP轉基因動物沒有被制作出來，或者沒有公開發布或者在公共平臺上保存，如果要自己制作轉基因動物的話，非常耗時間而且成本也很高，因此說要獲得需要的轉基因動物比較困難；

圖2. 用Cre和loxP轉基因老鼠進行基因敲除操作

1) 動物交配很耗時間：轉基因動物達到實驗室后，首先需要將轉基因動物的數量擴大，然后經過至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠，而交配一代小鼠至少需要2個月時間，所以至少需要半年時間才能拿到基因敲除的小鼠，因此說轉基因動物的交配很耗時間；

2) 區域或者組織特異性不高：因為轉基因小鼠依賴的基因敲除的特異性只能依賴于啟動子的調控，而有些啟動子并不能完全符合科研工作者對于區域或者組織特異性的要求，這樣就會使實驗結果不精確。

1.病毒依賴的基因重組

由于轉基因動物依賴的基因重組存在以上不足，現在越來越多的科研工作者開始采用比較靈活的方式使用Cre-loxP系統。通過病毒引入Cre或loxP元件，結合一種轉基因小鼠是比較常用的方式（圖3）。相比于轉基因動物依賴的基因重組，病毒依賴的基因重組有以下優點：

1) 更強的區域特異性：由于病毒可以通過局部注射的方式保證區域特異性感染，再加上驅動Cre基因的特異性啟動子，能夠實現更強的區域和細胞特異性的基因重組；

2)  更少的花費：購買轉基因動物的費用一般是比較昂貴的，而且轉基因動物的飼養、基因型鑒定都需要不少的人力、物力，而病毒的制備、保存和注射所花的費用相對來說是比較少的；

3) 更短的實驗周期：由于病毒能非常迅速的起作用，而轉基因小鼠的交配過程特別耗時間，因此采用注射病毒到轉基因小鼠體內的方式，可以大量縮短實驗周期。

圖3. 病毒依賴的基因敲除操作示意圖，注射Cre病毒進loxP轉基因小鼠體內（A），或者注射loxP病毒到Cre轉基因小鼠體內（B）

改造的Cre-loxP系統經過現代基因工程方法對Cre和loxP元件的改造，Cre-loxP系統實現了更加豐富的條件性重組策略。

1.對Cre元件的改造：對Cre元件的改造提高了Cre重組酶的活性，并且實現了藥物可誘導性。例如，通過在Cre元件上引入真核細胞核定位序列NLS，Cre重組酶能在低表達豐度下實現重組，這對于一些低豐度的啟動子很重要。另外，在Cre元件的C端接上一段改造過的配體結合結構域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD將定位在胞漿內，當人工合成的激素分子結合到Cre-LBD受體后，蛋白構象改變并進入核內，介導基因重組，目前使用最多的是tamoxifen誘導的CreERT2突變體，它的LBD來自于雌激素受體ER分子，當有tamoxifen的時候，Cre才能介導基因重組，這樣通過控制tamoxifen的注射時間，可以實現對基因重組時間特異性的調控；

2.對loxP元件的改造：loxP元件也有一些突變體，間隔區和回文序列都可以進行突變，突變后的序列依然能被Cre重組酶識別和重組，但是突變的loxP序列必須和同樣突變的loxP序列匹配介導基因重組，而不能和未突變的loxP序列匹配，這樣將不同的loxP序列組合用于控制多個基因，在同一Cre重組酶的作用下，可以實現多序列的基因重組，產生非常多元的重組結果。例如彩虹腦（Brainbow）技術絢麗多彩的熒光標記效果正式基于對loxP序列的改造實現。