抗血清的制備（二）

3、免疫途徑，劑量和免疫周期
 抗原注射途徑可根據不同抗原及試驗要求，選用皮內、皮下、肌肉、靜脈或淋巴結內等不同途徑注入抗原進行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴結周圍、耳后等處皮內或皮下多點注射。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2～4周。常規免疫方案為抗原加CFA皮下多點注射進行基礎免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加強免疫，每次間隔2～3周，皮下或腹腔注射加強免疫。
 1）常規（皮內多點注射）免疫：
 1第一次免疫：劑量為每只兔子注射1.0 ml抗原乳劑（含抗原量1～2mg）。注射部位為兩只后腳掌的皮內各注射0.2 ml，其余0.6
 ml分多點注入脊柱二側，頸部，腹股溝和腋窩等處淋巴結附近部位皮內，每點可注入0.05ml，分12點注入。
 2第二次免疫：初次免疫后20天左右，劑量為1.0ml/只（1～2 mg/ml），加福氏不完全佐劑。注射部位在腹部皮下多點注射，每點注入0.1 ml。
 3第三次免疫：再次免疫后兩周內進行，注射劑量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少許靜脈血，分離血清，試血測定效價。
 2）淋巴結免疫：主要優點是可減少抗原用量。過程如下：
 1卡價苗致敏：免疫前足掌皮下每側各注入活卡價苗（75 mg/ml）0.3 ml。10天左右觀察兩側腘窩淋巴結，一般可腫脹如蠶豆大小，此時即可進行淋巴結內免疫注射。
 2第一次免疫：用手指定淋巴結后在兩側腘窩淋巴結內各注入抗原乳劑0.25ml，每只兔總量0.5 ml；為加強免疫，于初次免疫20天后，于腹部皮下多點注射不加佐劑抗原溶液1mg/1ml。
 3二周后可如同第一次免疫的劑量和途徑再注射一次，一般可在第三次免疫注射前試血滴定效價，效價如已達到要求可不必進行第三次免疫。
 有條件的情況下，免疫后要加強動物飼料管理，如給熟黃豆飼養等。
 3）腹腔免疫：一般不必加佐劑，適用于細胞性或顆粒性抗原，而且抗原性較強者，例如用綿羊紅細胞免疫家兔或小鼠即可用此法。
4、試血，測定抗體效價
 一般在第三次免疫后7～10天即可于兔耳靜脈或小鼠尾尖取少量血，分離出血清之后進行試血。
 ① 環狀試驗，較為經典的方法，目前較少采用，如與20μg/ml以下的抗原于30 min內能出現“艸”的沉淀環，即測定抗體效價達1：5000以上時為合格。
 ② 免疫雙擴散法，這是最常用的試血方法，其具體方法是，中間孔加稀釋的抗原（1mg/ml）10μl，周圍孔順時針方向加制備的抗血清分別為1:2, 1:4,
 1:8，1:16，1:32和1:64，（用生理鹽水或PBS稀釋）。經37℃保溫24h后觀察結果，效價在1:16以上即可決定放血。
 5、放血
 經效價檢查合格后即可放血。放血前動物應停食12 h，以減少血清中的脂肪含量。如擬保留該免疫動物，可直接由心臟取血，或切開耳緣靜脈滴血或心臟穿刺取血。取血后由靜脈緩緩注入等量5%葡萄溶液以補足失血量。取血的動物經2～3個月休息，可再次加強免疫后取血。如擬一次放血致死，可用頸動脈放血的方法，各種取血方法如下。
 1）心臟取血：固定動物于仰臥位置，用食指探明心臟博動量高部位（在胸骨左側，由下向上數第3與第4助骨之間，指兔），剪去少許毛，用2.5%
 碘酒和75%酒精消毒后，以9#針頭在預定位置與胸部呈45。角刺入心臟，微微上下移動針頭，待見血液進入針筒后，即將注射器位置固定取血。2.5公斤體重的家兔一次可取血20～30ml。
 2）耳緣靜脈滴血：先將耳緣靜脈附近的毛剪去用無菌棉球將皮膚擦干凈（不用酒精消毒，避免溶血）。用臺燈照射耳部使血管因溫度增高而擴張，然后用無菌刀片將耳緣靜脈切一長0.5cm的縱切口，第一次切口應從耳尖部開始，以后再切時，逐步向耳根方向移動。用無菌試管或平皿收集流出的血液。如切口凝血，血流不暢時，可用無菌棉棒輕輕將切口外血凝塊擦去（注意勿使切口損傷太大），血流仍可繼續流出，直至達到所需要的血量為止。取血后用無菌棉球壓迫切口止血。耳緣靜脈取血一次可取血50ml左右而動物不死。
 3）頸動脈放血：使動物仰臥固定四肢，頸部剪毛、消毒后縱向切開前頸部皮膚長約10cm，用止血鉗將皮膚分開夾住，剝離皮下組織，露出肌層，用刀柄加以分離，即見搏動的頸動脈。小心將頸動脈和迷走神經剝離長約5cm，選擇血管中段，用止血鉗夾住血管壁周圍的筋膜。遠心端用絲線結扎，近心端用動脈鉗夾住，用酒精棉花球消毒血管周圍，用無菌剪刀剪一V形缺口。取長2.5cm、直徑為1.6mm塑料管一段，將一端剪成針頭樣斜面，并將此端插入頸動脈中，另一端放入200ml無菌三角瓶內，然后放開止血鉗，血即流入三角瓶內，動物流血至死，2.5公斤家兔可放血80～100ml。
 6、分離血清
 必須在無菌條件下進行，待收集于平皿或三角瓶內的血液凝固之后，用無菌滴管在無菌環境（例如超凈工作臺）中把血塊與瓶壁剝離后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃過夜，使血清充分析出（不能冰凍，否則產生溶血），經離心沉淀分出血清，放進低溫冰箱保存。使用前必須經過簽定合格后再分裝保存備用。
 7、抗血清的保存
 1）經簽定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的疊氮鈉，使其最后濃度分別為0.01%或0.05%。
 2）用無菌滴管將抗血清分裝小管，每管裝1ml左右。
 3）-20℃以下保存，可保存2年以上。
 4）如有條件可將血清冷凍干燥保存于4℃以下，保存時間更久
 五、注意事項
 1、動物的免疫反應存在著個體差異，甚至有人報告不同品種動物一次免疫后產生的抗體的差別可高達500倍，所以制備抗血清時不能只免疫一只動物，一般最好免疫3～4只，因為有的動物可能產生抗體效價很低或不產生抗體，免疫反應好的動物所能提供的抗體往往高于一般動物3～4倍。
 2、為制備單價特異性高的抗血清，所用抗原純度越高越好，因此，在純化抗原過程中應盡量除去可能存在的雜蛋白，這樣可以省去許多時間來吸收抗血清中的非特異性抗體。
 3、要制備高效價的抗體，必須要加佐劑（一般采用完全福氏佐劑），加佐劑后免疫動物，抗體效價至少可增加5倍。但也應考慮到，如果抗原中有微量的雜蛋白存在，即使0.005mg，亦可因有佐劑而產生非特異性的抗體，所以要根據實驗需要和抗原的純度適當地使用佐劑。
 4、制成的抗原乳劑是否為油包水乳劑應進行檢查，否則會影響免疫效果，如不是油包水乳劑，應重新制備。
 5、當抗原量過少不易提純時，可采用抗原抗體在瓊脂擴散中形成的沉淀線直接免疫動物制備抗體。
 6、抗血清效價一般以抗血清稀釋倍數表示。血清效價的檢測方法很多，靈敏度各不同，因此在表示抗血清效價時，應標明檢測方法。另外，在沉淀反應中，出現沉淀時的抗原、抗體比例有一較大的范圍，如用不同濃度的抗原測定效價時，結果會因此有別，所以在測定抗血清效價時，需注意抗原的濃度。
 7、分裝保存的抗血清應注明抗血清的名稱，效價，制備日期以及包裝量。