菌落計數工具大比拼

　　要想確定樣本里的細菌或病毒數，標準方法是進行系列稀釋并涂布平板，然后對平板上的菌落或蝕斑進行計數。“蝕斑是展現病毒完成感染循環的重要途徑，”哥倫比亞大學的病毒學家Vincent Racaniello說，他主要在動物細胞中研究脊髓灰質炎病毒和鼻病毒。

　　這項工作看起來簡單，不過一旦樣品多起來，難免會讓人心生厭煩。如果每天需要對成百上千的平板進行計數，那手動方法顯然并不現實。為此，人們開發出了帶有高分辨率彩色相機和多種照明模式的自動化菌落計數儀，這些儀器甚至可以識別肉眼難以看到的微小菌落。除了菌落計數之外，這類儀器還具有多種功能，例如讀取平板上的條碼標簽，對螺旋平板進行計數，以及測量抑菌圈等等。

　　The Scientist雜志對現有的一些菌落計數工具進行了比較分析，希望可以幫助研究者們做出最適合自己的選擇。

　　手動計數

　　目前，大多數研究細菌或酵母的實驗室，仍然選擇對菌落進行手動計數，英國Synbiosis公司的銷售經理Martin Smith說，這是一家專門生產自動化菌落計數儀的公司。

　　最基礎的菌落計數其實就跟數數一樣簡單。為了避免重復計數，許多研究者一邊計數一邊用記號筆在平板上做記號。也有一些研究者使用手持式的簡易計數器，并將平板放在照明盒上，讓菌落更加清晰。

　　美國Cole-Parmer公司提供一種菌落計數筆，可以感應到在平板上做標記時的壓力，在發出信號音的同時計數。不過，有些用戶覺得這種計數筆的墨水干得太快。英國Bibby公司的SC6PLUS菌落計數器也是一款類似產品，它同樣基于壓力感應，并且帶有一個平板支架和內置放大鏡。此外，西班牙IUL公司也生產類似的菌落計數器。

　　通量：手動計數適用于平板不多的基礎研究者。據估計，完成100個85mm平板(每板30–300個菌落)的計數，大約需要半天。Racaniello指出，對100個6孔板(每孔10-100個蝕斑)進行計數大概需要一到兩個小時。

　　精確性：不同操作者的計數可能會存在一點差異，不過每板計數三次，可以保證結果的可靠性。

　　優點：經濟、簡便

　　缺點：單調繁瑣、容易引入人為誤差、有損健康

　　Tips：如果平板上的菌落超過兩百，可以對其進行分區計數，然后估算出總數。這樣能節省不少時間，但結果不會非常精確。另外，盡量由同一個人計數所有平板，以保證結果的一致性。

　　自動菌落計數儀

　　現在有不少科學家已經開始使用自動化的菌落計數儀，你可以選擇簡單的計數模塊，也可以搭配復雜的分析軟件。

　　基本款：Synbiosis公司的aCOLyte 3，是一款直觀且便宜的入門級菌落計數儀。這款儀器能夠識別直徑小至0.3mm的菌落或蝕斑，并計算總數。此外，IUL公司的Flash & Go也提供基本的計數功能。這類系統并不帶有特殊的額外功能，基本只是單純的計數。

　　進階款：高端一些的菌落計數儀，除了能對菌落和蝕斑進行計數以外，還具有許多其它功能。例如，Synbiosis公司的Protocol 3能夠提供菌落或蝕斑的大小和形態數據，還可以利用內置軟件對抑菌圈進行測量。ProtoCOL 3的可選模塊還可以實現更多功能，包括對螺旋平板進行計數，Ames實驗分析等等。Ames實驗是通過測定組氨酸依賴型細菌的突變率，來鑒定致癌物的一種方法，突變可以使這些細菌獲得在無組氨酸培養基上生長的能力。

　　據Smith介紹，ProtoCOL 3系統所帶的相機，可以識別人類肉眼勉強可見的菌落(小至43微米)。當然，許多其他公司的類似計數儀也能夠識別小于100微米的菌落。

　　IUL公司的Flash & Grow菌落計數儀也可以實現多種功能，該儀器的基礎配置中含有區分顏色和大小的軟件模塊。如果選擇抑菌圈測量模塊，也可以將其用于抗生素藥物的測試。

　　絕大多數自動菌落計數儀帶有彩色相機，允許用戶區分不同顏色的菌落。UVP公司的ColonyDoc-It菌落計數系統，還能夠識別表達綠色熒光蛋白的菌落。ColonyDoc-It和ProtoCOL3都帶有拉門，可以防止外部環境光線對平板產生影響，確保成像時的照明條件。

　　通量：自動菌落計數儀能夠實現對成百上千平板的高通量計數，對于制藥企業、水或食品安全實驗室特別有用。據估計，手動計數一個平板平均可能需要73秒，而用Flash & Go等自動菌落計數系統只需要一兩秒。為了實現高通量，IUL還提供有一款平板處理系統，能夠自動裝載八十塊平板進行成像。

　　精確性：自動化系統的精確性很好，一些研究者更信賴自動化系統所提供的結果。

　　優點：快速、可避免人為因素造成的誤差、內置多種分析功能

　　缺點：價格較高。此外，形態怪異或過于接近的菌落、霉菌、殘渣、平板上的書寫痕跡、培養基中的氣泡都可能對計數準確性造成影響，需要用戶進行校正。

　　Tips：拿到儀器后先進行驗證，將儀器計數與之前的常用方法進行比較。保持平板底部清潔，在平板蓋或側面做標記。

　　另外，Bern 大學的Silvio Brugger設計了DIY菌落計數儀，并用它來研究肺炎球菌(PLOS ONE, 7:e33695, 2012)。如果難以承受高端計數儀的價格，又對計數功能有一定的需求，那么DIY也許可以成為一種另類的選擇。