NorthernBlot技術

[儀器、試劑、材料]
（一）儀器
恒溫水浴箱，電泳儀，凝膠成像系統，真空轉移儀，真空泵，UV 交聯儀，雜交爐，恒溫搖床，脫色搖床，漩渦振蕩器，分光光度計，微量移液器，電爐（或微波爐），離心管，燒杯，量筒，三角瓶，等。 
（二）材料
總RNA樣品或mRNA樣品，探針模板DNA(25 ng)，尼龍膜
（三）試劑
NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），瓊脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，雙氧水, 滅菌水等。

[方法與步驟]
1. 用具的準備：
180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。
電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。
處理DEPC水(2 L)備用。

2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。

3．制膠： 
1． 稱取0.36mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發的水分) 
2． 在通風廚中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，輕輕振蕩混勻。
注意盡量避免產生氣泡。
3． 將熔膠倒入制膠板中，插上梳子
如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或將氣泡推到膠的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5cm。
4．膠在室溫下完全凝固后，將膠轉移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm，小心拔出梳子。（配制250ml　1＊MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補充蒸發的buffer。）
5．檢查點樣孔。

4. RNA樣品的制備
在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB（終濃度為10ug/ml）。混勻后，65℃空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。

5. 電泳：
1. 將RNA樣品小心加到點樣孔中。
2. 在5V/cm下跑膠（5ｘ14cm）。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續電泳。當膠中的溴紛藍（500bp）接近膠的邊緣時終止電泳。
3. 紫外燈下，檢驗電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。
注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。

6. 轉膜
1．用3%雙氧水浸泡真空轉移儀后，用DEPC水沖洗。
2．用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。
3．連接真空泵和真空轉移儀，剪取一塊適當大小的膜（膜的四邊緣應大于塑膠屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當位置。
4．蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。
5．將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣約2mm，以防止漏氣。
6．將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。
7．打開真空泵，使壓強維持在50~58mbar；立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer，真空轉移2小時。
8．轉膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余的膠和鹽。
9．用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯儀中自動交聯。
10．將膠和紫外交聯后的膜，在紫外燈下檢測轉移效率。(避免太長的紫外曝光時間)
12．將膜在-20℃保存。

7. 探針的制備
1．在1.5ml離心管中配制以下反應液：
模板DNA(25 ng) 　　　　1ul
Random Primer 2ul
滅菌水 11ul
總體積：14ul
2．95°C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5min。
3．在離心管中按下列順序加入以下溶液：
10×Buffer 2.5ul
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
Exo-free Klenow Fragment 1 ul
4．混勻后（25ul），37°C下反應30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。
5．65°C加熱5min使酶失活。
　　　
8. 探針的純化及比活性測定：
1．準備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數次，以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的TE（PH7.6）。
2．取1ml一次性注射器，去除內芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。
3．將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘，凝膠壓緊后，補加Sephadex G-50凝膠懸液，重復此步直至凝膠柱高度達注射器0.9ml刻度處
4．100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min。重復3次。
5．倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準1.5ml離心管。
6．將標記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點樣于DE8　paper上，其余上樣于層析柱上。
7．1600g離心4min，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點樣于DE8-paper. 
8． 測比活性(試劑比活要求:106cpm/ml）。　

9．預雜交：
1．將預雜交液在雜交爐中68℃預熱，并漩渦使未溶解的物質溶解。
2．加入適當的ULRAhyb到雜交管中(以100cm2 膜面積加入10mlULRAhyb雜交液)，42℃預雜交4 hr。

10．探針變性：
1．用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。
2．90℃熱處理稀釋后探針10min后，立即放置于冰上5min。
3．短暫離心，將溶液收集到管底。

11．雜交：
1．加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預雜交液中。
2．42℃雜交過夜（14~24hr）。
雜交完后，將雜交液收集起來于－20℃保存。

12．洗膜： 
1．低嚴緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，室溫下，搖動洗膜5min兩次。 
2．高嚴緊性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，42℃ 搖動洗膜20min兩次。 

13．曝光：
1． 將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。
2． 檢查膜上放射性強度，估計曝光時間
3． 將X光底片覆蓋與膜上，曝光
4． 沖洗X光底片，掃描記錄結果。

14．去除膜上的探針：將200ml　0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，將膜放入，室溫下讓SDS冷卻到室溫，取出膜，去除多余的液體，干燥后，可以保存幾個月。

15．雜交結果 

操作應該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解。轉膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡。