qPCR實驗的Ct值的合理范圍

理性闡述 qPCR 實驗的 Ct 值的合理范圍。（附 Ct 值過大或過小的解決方法）

Ct 值是什么？

Ct 值具有什么樣的作用？

Ct 值的正常范圍是多少？

Ct 值太大或者太小的原因？

Ct值是熒光定量PCR最重要的結果呈現形式。它被用于計算基因表達量差異或者基因拷貝數。那么熒光定量的Ct值多大可被認為是合理？如何保證Ct值的有效范圍呢？今天就讓我來為大家解答這個問題。

Ct 值是什么？

qPCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時的所對應的擴增循環數（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。簡單講，Ct值就是qPCR中起始模板擴增達到一定產物量時，所對應的循環數。所謂“一定產物量”后續作進一步解釋。

Ct 值有什么作用？

1.指數擴增、模板量與Ct值的關系

理想情況下，qPCR中的基因經過一定的循環數被指數擴增而積累，擴增循環數和產物量之間的關系是： 擴增產物量 = 起始模板量×（ 1+E n ）循環個數 。然而qPCR反應并不是一直處于理想情況下，當擴增產物量達到“一定產物量”時，此時循環個數為Ct值，處于指數擴增時期。 Ct 值與起始模板量的關系 ：模板的Ct值與該模板的 起始拷貝數的對數存在線性關系 。起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。

2.擴增曲線、熒光閾值與一定產物量

qPCR擴增產物量是以熒光信號的形式直接呈現，也就是擴增曲線。在PCR早期，擴增處于理想情況下，循環數較少，產物積累少，產生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯地區別，之后熒光的產生增加進入指數期。可以在PCR反應剛處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，以此作為“一定產物量”，并且由此來推斷模板最初的含量。因此，一定產物量對應的熒光信號強度，也就是熒光閾值。

在PCR的后期，擴增曲線不再呈現指數擴增，進入線性期和平臺期。

3.Ct值的重現性

PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。

Ct 值的范圍？

1.擴增效率En

PCR擴增效率是指聚合酶把待擴增基因轉變生成擴增子的效率。由1個DNA分子轉變生成2個DNA分子時的擴增效率為100%。擴增效率常用En表示。為了方便后續文章的分析，簡要介紹下影響擴增效率的因素。

影響因素 解釋 如何判定？

A.PCR抑制劑1.模板RNA中可能含有抑制PCR反應的物質，如蛋白質或去污劑等。

2.反轉錄后的cDNA中含有高濃度的模板RNA和反轉錄試劑成分，也可能對后續PCR存在抑制。

1.可通過測定A260/A280和A260/A230比值或RNA電泳，判斷是否存在污染。

2.反轉錄后cDNA是否按照一定比例進行稀釋。

B.引物設計不合理引物不能有效退火檢查引物是否存在二聚體或發夾結構、存在錯配；有時需注意跨內含子設計。

C.反應程序不合適1.引物不能有效退火。

2.DNA聚合酶活性未充分釋放，

3.長期高溫，DNA聚合酶活性下降。

1.退火溫度高于引物Tm值。

2.預變性時間太短。

3.反應程序各階段時間過長。

D.試劑未充分混勻或移液誤差反應體系中，PCR反應成分的局部濃度過高或不均勻，導致PCR擴增不呈指數擴增。

E.擴增子長度擴增子長度太長，超過300bp，擴增效率低。檢查擴增子長度是否在80bp-300bp之間。

F.qPCR試劑的影響試劑中DNA聚合酶濃度較低或Buffer中離子濃度非最優化，導致Taq酶活力未達最強。標準曲線測定引物擴增效率。

2.Ct值的范圍

Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認為擴增在基線期范圍內，未達到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數的對數存在線性關系，也就是標準曲線。通過標準曲線，擴增效率為100%時，計算出基因單個拷貝數定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數小于1，可認為無意義。

對于不同的基因Ct范圍，因起始模板量中基因拷貝數和擴增效率不同，需做出該基因的標準曲線，計算出基因的線性檢測范圍。

3.Ct值的影響因素

由擴增循環數和產物量之間的關系： 擴增產物量 = 起始模板量×（ 1+E n ）循環個數 ，可以看出，在理想條件下，起始模板量和En會對Ct值產生影響。模板質量或者擴增效率的差異會造成Ct值偏大或過小。

4.Ct值過大或過小

小翊威逼利誘了我公司技術部的牛牛們，總結出Ct值常見的兩類問題的原因和解決方法，以饗讀者。

問題 可能的原因 解決方法

Ct值過大1.模板濃度低或存在PCR抑制物

2.擴增效率低

1.提高模板濃度；或提高RNA或cDNA稀釋比例；或重新制備模板。

2.降低退火溫度，或選用二步法擴增；組分和體系充分混勻；優化反應程序；或嘗試更換試劑。

Ct值過小1.模板濃度高

2.NTC和NRC存在污染

3.引物設計不合適

1.減少模板RNA量；或更高比例稀釋cDNA。

2.重新更換所有試劑；或使用UDGase防污染試劑。

3.優化程序，避免非特性擴增。