個人經驗,僅供參考:
1.用脫脂奶粉封閉的效果不一定比用BSA差,不過我們試過幾種奶粉,有一些奶粉不太適合.推薦使用的奶粉:雀巢高鈣奶粉,多力精低脂奶粉.一般國產的奶粉的顆粒比較大,不太容易溶解.
2.關于三名治:本人以前做時花很多時間在防止短路上,現在我做的時候根本沒有剪齊,最主要的是趕氣泡,這是關鍵的關鍵,其實轉膜的原理是電流的單向流動,現在的好多公司的轉膜裝置的電極是一個平面,所以不用擔心短路的.(不信的可以試試!!)
3.關于轉膜時的溫度:轉膜時的溫度比較重要,最好保持在10度以下,可以用冰浴(Pharmacia的轉膜裝置),也可以在轉膜液中放入合適的事先準備的冰袋(-70度>3小時)(Bio-Rad),這樣既可以降溫又可以節約Buffer.
4.關于轉膜電流和時間:一般轉膜的電流在200mA-400mA之間時間為1小時,大片段的>50KD的可以選用350mA,小片段的可以用250mA,不過本人覺得上述電流均能很好的把大部分蛋白轉過去.
5.關于反復標記和再標記:一張膜上可以同時標記很多抗體,但要注意,一般在兩個目的蛋白相差在5KD以上的,最好先后兩個抗體是不同的二抗.在兩個目的片段相差小于5KD時,就需要經過處理,再標記了(Re-Blot),有些公司有再標記的現成試劑,不過比較貴,最簡單的方法是:ddH2O洗5分鐘,0.2MNaOH5分鐘,再用ddH2O5分鐘*3次,然后可以再標記了.要做多個抗體的膜\的選擇,最好用PVDF或教堅固的,推薦用Amsham的Hybond-P,Hybond-Extra.本人最多在一張膜上做個10個不同的抗體.
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