武大雷組缺氧誘導因子HIF2的激動劑，靶向貧血

　　缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors, HIFs）是人體內一類重要的轉錄因子， 可通過調節與紅細胞生成、血管新生以及無氧代謝相關基因的轉錄，協助機體應對缺氧造成的壓力【1】。因此HIF通路的活性異常，與癌癥和貧血等多種疾病緊密相關。

　　具有轉錄活性的HIF蛋白復合體由HIF-α和ARNT（即HIF-1β）兩個亞基組成，而HIF-α蛋白有三種亞型，其中HIF-2α的過表達和活化是導致腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）的主要原因。目前直接作用于HIF-2α的小分子拮抗劑PT2385（及其類似物PT2977）已經進入治療ccRCC的二期臨床試驗，通過阻斷HIF-2α與二聚伙伴ARNT的結合發揮抑制作用【2】，但其具體的分子機理尚不清晰。

　　另一方面，脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain, PHD）的多個小分子抑制劑，在治療腎性貧血的三期臨床試驗中展現出良好效果【3】。特別是琺博進公司（FibroGen）的羅沙司他（roxadustat），作為I類新藥2018年底剛剛被CFDA批準在中國首發上市。HIF-2α蛋白降解依賴于PHD對它的羥基化，因此這些抑制劑可以間接提高HIF-2α的蛋白水平和轉錄活性，增強下游基因促紅細胞生成素（eythropoietin，EPO）的表達。但HIF-2α是否可被化合物直接激活、作為治療貧血和缺血性疾病的潛在新靶標還未見報道。

　　2019年2月25日，山東大學微生物技術國家重點實驗室武大雷課題組和牛津大學Fraydoon Rastinejad課題組在Nature Chemical Biology上在線發表了題為Bidirectional Modulation of HIF-2 Activity through Chemical Ligands的研究論文。該研究通過體外化合物篩選首次發現了直接結合HIF-2α蛋白的小分子激動劑，并利用蛋白-化合物共晶、氫氘交換質譜等手段，揭示了拮抗劑和激動劑如何通過HIF-2α-ARNT二聚界面處不同氨基酸殘基的變構效應、影響二聚體穩定性并雙向調節其轉錄活性的分子機理，為靶向HIF-2α蛋白設計新的抗癌（拮抗劑）和抗貧血（激動劑）藥物提供了重要依據。

　　研究發現，拮抗劑PT2385結合在HIF-2α蛋白的PAS-B結構域中，使原本朝向結合口袋內部的M252殘基側鏈向二聚界面處外翻，從而降低了HIF-2α-ARNT二聚體的穩定性（圖1a）。然后利用定點突變等手段，在生化和細胞水平都確證了M252是介導PT2385等拮抗劑發揮作用的關鍵殘基。而且通過比較HIF-2α-ARNT二聚體與多種拮抗劑的共晶結構（包括PT2385、之前報道的拮抗劑0X3以及本研究中發現的新骨架拮抗劑T1001等），發現拮抗劑的活性與其對M252殘基側鏈的外翻程度呈正相關（圖1b）。這些結果揭示了拮抗劑以變構效應抑制HIF-2轉錄活性的具體機理，并為改造和設計新的HIF-2α拮抗劑提供了重要參考。

圖1：HIF-2α拮抗劑的變構機理。a， PT2385結合HIF-2α所引起的二聚界面處關鍵殘基的構象變化；b，拮抗劑的抑制活性與其對M252殘基側鏈的變構程度相關。

　　研究還發現了可直接作用于HIF-2α蛋白的小分子激動劑。有意思的是，跟拮抗劑相似，這類激動劑也結合在PAS-B結構域中，但卻導致二聚界面處不同氨基酸殘基的構象變化。共晶結構顯示激動劑使HIF-2α Y281殘基的側鏈外翻，從而與臨近的ARNT Y456 殘基形成額外氫鍵，使二聚界面更加穩定（圖2a）。隨后的氫氘交換質譜實驗證明了激動劑對HIF-2α-ARNT二聚體的穩定作用，而點突變實驗也驗證了Y281對激動劑的變構效應非常關鍵。HIF-2α激動劑的發現及其作用機理的闡明，為HIF-2通路的功能研究提供了新的小分子工具，也為發現和設計活性更高的激動劑提供了關鍵信息。此外，研究發現在Hep3B細胞中，HIF-2α激動劑可與PHD抑制劑協同提高EPO基因表達（圖2b），提示這兩種提高HIF-2通路活性的策略或可聯合采用，為腎性貧血及其他缺血性疾病的治療提供了新的思路。

圖2：a，激動劑M1001增強HIF-2α-ARNT二聚體穩定性的變構機理；b，激動劑M1002與PHD抑制劑molidustat或roxadustat（羅沙司他）的協同效應。

　　總之，此項研究所揭示的小分子通過變構效應影響二聚體穩定性、從而雙向調節HIF-2通路活性的作用機理（圖3），為設計更好的HIF-2α拮抗劑和激動劑指明了方向，也初步證明HIF-2α可作為治療癌癥和貧血性疾病的潛在雙面靶標。此外，探尋調控轉錄活性的內源性配體一直是HIF研究領域的熱點問題之一。本研究發現的激動劑，為潛在內源配體特別是某些代謝中間產物，參與精確調控HIF通路提供了一種可能的作用方式，也將有助于HIF-α蛋白內源性配體的發現。

圖3：拮抗劑和激動劑結合在HIF-2α蛋白的同一口袋中，通過改變二聚界面處不同氨基酸殘基側鏈的構象，影響HIF-2α-ARNT二聚體穩定性和轉錄活性。

　　據悉，本論文以山東大學微生物技術國家重點實驗室的武大雷教授為第一作者，武大雷和英國牛津大學的Fraydoon Rastinejad教授為共同通訊作者。山大的博士研究生刁曉彤也是該項研究的參與者之一。

　　武大雷教授是山大 “齊魯青年學者”，博士生導師。2003年在山大生命科學學院獲得學士學位，2008年在中科院上海藥物研究所獲得博士學位。畢業后在美國加州大學戴維斯分校和桑福德伯納姆醫學研究所從事博士后研究，2016年9月回到山大工作。主要研究領域為轉錄因子靶點蛋白的結構和功能及其藥物發現，包括bHLH-PAS蛋白家族和核受體家族等。在Nature、Elife、Nature Communications等期刊上發表過多篇研究論文【4-6】，谷歌學術H-index值為19。目前課題組正在招聘博士后，歡迎對結構與分子藥理學領域感興趣的有志之士和武大雷教授聯系（e-mail: dlwu@sdu.edu.cn）。