放射性標記DNA探針的制備
l 聚丙烯酰胺凝膠的制備
1．按照（三）中操作流程灌制非變性聚丙烯酰胺凝膠。將10×TBE稀釋成0.5×的工作濃度。聚丙烯酰胺的工作濃度取決于待測DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝膠，小于100bp的片段應灌制6～8％的凝膠。
l DNA的標記
1．用兩種限制性內切酶從10μg質粒上將待測DNA片段切下。注意務必使至少一種酶酶切后產生5’凸出末端。酶切體系終體積50μl，在適宜的酶反應緩沖液條件下反應1小時。
2．向酶切反應混合液中加入
[α－32P]dATP（約10μCi/μl）(若5’凸末端含T殘基) 10μl
dCTP(2mmol/L) 1μl
dGTP(2mmol/L) 1μl
dTTP(2mmol/L) 1μl
DNA聚合酶（Klenow片段）（5單位/μl） 1μl
室溫溫育反應體系30分鐘。
3．加入7μl 10×上樣緩沖液終止反應。
l 標記探針的分離
1．將反應混合物上樣于非變性凝膠。
2．10～15V/cm條件下，用0.5×TBE緩沖液電泳2～3小時。
3．將玻璃板從電泳槽中取出，分開，并使凝膠粘附于其中任一塊板上。用保鮮膜將凝膠覆蓋起來。
4．將凝膠室溫下對X光片曝光1分鐘。小心操作使得顯像后的X光片與凝膠能以曝光時方位復原。
5．用保鮮膜覆蓋在放射性自顯影照片上。再將帶凝膠的玻璃板放在其上，以照片為模板，用刀片切下含標記DNA片段的凝膠片。將該凝膠片切成小片（約1mm2）后，放入微量離心管中。
6．向管中加入1ml洗脫緩沖液，37℃連續振蕩，溫育過夜。
7．將洗脫液轉入兩個干凈微量離心管中（每管500μl），然后各加入1ml 100％乙醇，－80℃放置10分鐘。室溫離心15分鐘沉淀DNA。
8．棄上清，用80％乙醇洗沉淀，室溫離心5分鐘，用長頸巴斯德吸管移去上清，再用真空離心蒸發濃縮器或干燥器干燥沉淀。
9．用閃爍計數器測定樣品中的契侖科夫輻射量。將沉淀溶于適量TE中使標記探針的濃度為約104cpm/μl。
大腸桿菌感受態細胞的制備 1．用2ml噬菌體肉湯培養基培養大腸桿菌，37℃下振蕩過夜。 2．接種1ml上述大腸桿菌培養液于100ml噬菌體肉湯培養基中，37℃振蕩培養至OD600＝0.4為止。 3．4℃下，3000r/min離心5分鐘，用10ml TM緩沖液重懸菌體，菌體可在4℃下保存5天而不明顯失去其感受態特性。 大腸桿菌的感染和蛋白合成的誘導 1．在每一直徑150mm培養皿中加入70ml含瓊脂的噬菌體固體培養基，制備篩選平板。平板數取決于實驗設計，平板使用前在通風廚內風干2～3小時。 2．用SM緩沖液稀釋噬菌體貯液至濃度為5×106pfu/ml. 3．微波爐融化上層瓊脂糖，50℃保溫備用。 4．在15ml帶螺旋蓋的管中加入600μl大腸桿菌感受態細胞，用4～6μl稀釋噬菌體貯液感染，讓噬菌體在室溫下吸附20分鐘。為實驗準備足夠量的樣品數目。 5．加10ml軟瓊脂至每一噬菌體感染的大腸桿菌樣品中，顛倒2～3次后倒入150mm的噬菌體平板（已在37℃預熱30分鐘）上。向各個方向傾斜使軟瓊脂完全覆蓋表面，避免產生氣泡。 6．室溫下使軟瓊脂糖固化（需5分鐘），倒扣平板在42℃下培養4小時。 7．在培養期間，用圓珠筆標記132mm硝酸纖維素濾膜。 8．在10mmol/L IPTG水溶液中浸泡硝酸纖維素膜幾分鐘，使濾膜風干，但不要完全干燥。 9．42℃培養4小時后，噬菌體平板上的噬菌斑正好可以看見。若噬菌斑還沒有出現，再培養一會兒。5小時后應該能看見噬菌斑。當能分辯噬菌斑時，把硝酸纖維素膜放在平板上面，使其所作標記面對軟瓊脂的上表面。用防水筆在平板底部按硝酸纖維素濾膜上的標記標記上，置于37℃培養4小時。 10． 重復第7和第8步以準備第二組IPTG浸泡硝酸纖維素濾膜。 11． 用鑷子小心將第一組濾膜從平板上移開，放置于Whatman 3MM紙上，使其噬菌斑面朝上。為防止軟瓊脂上層的剝脫，在移去濾膜前應將平板4℃冷卻5～10分鐘。 12． 將第二組濾膜放在平板上，在每塊平板底部按濾膜上的標記標記上，在37℃培養2～4小時。 13． 第二組濾膜溫育期間，開始操作第一組濾膜。移開第二組濾膜后，應將平板置于4℃保存直至鑒定出陽性噬菌斑。 變性、復性和封閉 1．將含有噬菌斑的硝酸纖維素膜放在變性緩沖液中（每100ml 4張濾膜），溫和搖晃10分鐘。 2．移去50ml變性緩沖液，加50ml Dignam緩沖液，溫和搖5分鐘。 3．重復4次步驟2。 4．將濾膜轉入新鮮Dignam緩沖液中溫和振蕩5分鐘。 5．用結合緩沖液漂洗濾膜。 6．將濾膜放進BLOTTO緩沖液中（每100ml 4張濾膜）4℃下溫和振蕩1小時。這一步將阻斷DNA探針與濾膜的非特異性結合。 7．用Dignam緩沖液快速漂洗濾膜。 結合反應 1．將濾膜放進含有放射性標記DNA探針的結合緩沖液中，4℃下溫和振蕩至少1小時。 2．用結合緩沖液溫和振蕩漂洗（5分鐘）濾膜（每100ml 4張濾膜）。重復此步一到二次。用蓋革計數器監測濾膜上放射性強度。除結合緩沖液必須保存在4℃外，這些漂洗步驟均可在室溫下進行。 3．將濾膜放在Whatman 3MM紙上，以吸去殘余的液體。用Saran?膜包裹濾膜。 4．將兩套濾膜對X光片在－80℃下曝光過夜。 5．放射自顯影顯像。 陽性噬菌斑的鑒定 1．將每張硝酸纖維素濾膜的放射性自顯影照片與噬菌體平板底部的標記對齊，噬菌體表達的DNA結合蛋白將會在第一和第二張濾膜的放射自顯影照片上給出信號。 2．用粗口頸巴斯德將含有陽性噬菌體的每個瓊脂糖凝膠塊移入500μl SM緩沖液中，4℃下放置數小時使噬菌體得以充分擴散。 第二和第三輪篩選 1．準備第二和第三輪篩選的噬菌體平板，在每一直徑90mm培養皿中加入30ml含噬菌體固體培養基。平板數取決于實驗設計，使用前在37℃溫箱中風干2～3小時。 2．按如下步驟確定噬菌體貯液的效價 a. 用在SM緩沖液稀釋噬菌體貯液至10－2、10－3、10－4。 b. 向5ml螺旋蓋的管中加入各稀釋液1μl和250μl大腸桿菌感受態細胞并混合，室溫下放置20分鐘。 c. 用微波爐熔化軟瓊脂，冷卻至50℃備用。 d. 加4ml軟瓊脂入細菌/噬菌體混合液中，并全部涂布于上述噬菌體平板上。 e. 室溫下讓上層軟瓊脂固化，37℃培養過夜。通過計算所形成的噬菌斑的數目來確定效價。 3．除了用100～300pfu的噬菌體或將250μl大腸桿菌感受態細胞和并涂布用4ml軟瓊脂90mm噬菌體平板外，按第一輪篩選的步驟進行第二輪篩選。用直徑82mm的硝酸纖維素濾膜匹配直徑為90mm噬菌體平板。在第二輪篩選中每塊平板的陽性噬菌斑應增加。 4．用口徑小的巴斯德吸管將陽性噬菌斑移開――盡量挑單個噬菌斑。將每一瓊脂小塊放入100μl SM緩沖液中，并使噬菌體4℃下擴散數小時。確定噬菌體貯液的效價。 5．除用兩個不同的DNA探針來了解表達蛋白的結合特異性外，按步驟3所述程序進行第三輪篩選。為方便起見，將帶有噬菌斑的濾膜切成兩半，一半與野生型探針保溫，另一半與含有突變的DNA結合位點的探針保溫，序列特異性DNA結合蛋白將與野生型作用而不與突變型探針作用。