用原位篩選法分離編碼序列特異性DNA結合蛋白的cDNA
放射性標記DNA探針的制備l 聚丙烯酰胺凝膠的制備1．按照（三）中操作流程灌制非變性聚丙烯酰胺凝膠。將10×TBE稀釋成0.5×的工作濃度。聚丙烯酰胺的工作濃度取決于待測DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝膠，小于100bp的片段應灌制6～8％的凝膠。 l DNA的標記1．用兩種限制性內切酶從10μg質粒上將待測DNA片段切下。注意務必使至少一種酶酶切后產生5’凸出末端。酶切體系終體積50μl，在適宜的酶反應緩沖液條件下反應1小時。2．向酶切反應混合液中加入[α－32P]dATP（約10μCi/μl）(若5’凸末端含T殘基) ......閱讀全文
用原位篩選法分離編碼序列特異性DNA結合蛋白的cDNA
放射性標記DNA探針的制備l??????聚丙烯酰胺凝膠的制備1．按照（三）中操作流程灌制非變性聚丙烯酰胺凝膠。將10×TBE稀釋成0.5×的工作濃度。聚丙烯酰胺的工作濃度取決于待測DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝膠，小于100bp的片段應灌制6～8％的凝膠。?l??????DN
液相法篩選cDNA表達文庫中RNA結合蛋白實驗
將 cDNA 文庫表達的蛋白固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后用標記的 RNA 對其進行篩選的方法是篩選 RNA 結合蛋白研究中最常用的技術。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。實驗方法原理將 cDNA 文庫表達的蛋白固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后用標記的 RNA 對其進行篩選的方法
液相法篩選cDNA表達文庫中RNA結合蛋白實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 將 cDNA 文庫表達的蛋白固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后用標記的 RNA 對其進行篩選的方法是篩選 RNA 結合蛋白研究中最常用的技術。 實驗材料
液相法篩選cDNA表達文庫中RNA結合蛋白實驗
實驗方法原理 將 cDNA 文庫表達的蛋白固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后用標記的 RNA 對其進行篩選的方法是篩選 RNA 結合蛋白研究中最常用的技術。實驗材料 TY試劑、試劑盒 儲存液溶菌酶干粉細菌裂解緩沖液甘油水溶液實驗步驟 一、材料與設備1. 2X TY：16 g 蛋白胨，10 g 酵母提
利用λ噬菌體文庫篩選－DNA－結合蛋白實驗
可利用合成雙鏈寡核苷酸篩選構建于λ噬菌體的 cDNA 表達文庫，以鑒定與特異 DNA 結合蛋白質相對應的克隆（Singhetal.1988,Vinsonetal.1988)。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。試劑、試劑盒ATP結合緩沖液變性溶
利用λ噬菌體文庫篩選－DNA－結合蛋白實驗
試劑、試劑盒 ATP結合緩沖液變性溶液二硫蘇糖醇EDTA乙醇激酶 連接酶緩沖液酚氯仿篩選緩沖液SDS醋酸鈉TET4 噬菌體 DNA 連接酶T4 噬菌體多核苷酸激酶合成的寡核苷酸[a-32P]ATP非變性聚丙烯酰胺凝膠儀器、耗材 烤盤結晶皿平頭鑷子裝有防水黑墨水注射器硝酸纖維素濾膜Sephadex G
利用λ噬菌體文庫篩選－DNA－結合蛋白實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 ATP 結合緩沖液 變性溶液 二硫蘇糖醇 EDTA 乙醇激酶 連接酶緩沖液 酚 氯
用大片段基因組－DNA－克隆直接篩選－cDNA實驗
試劑、試劑盒 擴增緩沖液DNA 聚合酶 DNaseI限制性內切核酸酶ATP鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液T4DNA 連接酶熱穩定 DNA 聚合酶瓊脂糖凝膠BACDNA缺口平移緩沖液雜交液平末端 cDNACot1 基因組 DNA胞漿 poly(A)+RNAdNTP 溶液DNA 分子質量標志物寡
用大片段基因組－DNA－克隆直接篩選－cDNA實驗
本方案使用克隆在 BAC 載體上的一段 500kb 的人基因組 DNA 連續序列，直接篩選與其互補的的 cDNA。但本方法也可適用于任意大小的基因組靶 DNA。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。試劑、試劑盒擴增緩沖液DNA 聚合酶 DNaseI限制性內切核酸酶ATP鏈霉親和素
用大片段基因組－DNA－克隆直接篩選－cDNA實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 擴增緩沖液 DNA 聚合酶 DNaseI 限制性內切核酸酶 ATP 鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液 T4DNA 連接酶
序列特異性DNA結合蛋白親和層析純化實驗_DNA親和層析法
實驗材料制備性的DNA親和層析樹脂試劑、試劑盒緩沖液Z或其他柱緩沖液（如緩沖液Ze或TM)配制時含不同的KCl濃度（從緩沖液 Z 0.1 mol L KCl 至緩沖液 Z 1 mol L KCl對緩沖液Z 0. 1 mol L KCl透析的部分純化的蛋白質組分非特異性的競爭DNA柱再生緩沖液柱儲存緩
什么是非特異性的DNA結合蛋白
為DNA蛋白質之一種，是與單鏈DNA有強的親和性，與DNA復制、遺傳的重組等DNA代謝有關的蛋白質。也稱螺旋不穩定蛋白質（helix destabili－zing protein），又稱解DNA旋卷蛋白質（DNAuntwisting protein）。此蛋白質與單鏈DNA協同（cooperative
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
用鹽酸胍進行干燥膜的變性/復性循環試劑、試劑盒HEPES結合緩沖液實驗步驟1) 按基本方案步驟1?15進行。2) 將平皿在4℃冷卻10 min。用針扎孔標記各膜的位置。小心地揭起膜，室溫下在空氣中瞭干15 min。3) 將膜浸于HEPES結合緩沖液/6 mol/L鹽酸狐中，4℃輕輕搖動溫育10 mi
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
從重組溶源菌中制備粗提物鑒定DNA結合蛋白的活性實驗材料大腸桿菌 Y1089試劑、試劑盒含有或不含10 mmol L MgCl2的LB培養液1010pfu mLλgtU重組噬菌體液1 mol L IPTG抽提緩沖液5 mg mL溶于抽提緩沖液中的溶菌酶（保存于-20℃)儀器、耗材4 mol L Na
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
實驗方法原理 實驗材料 含有多個串聯拷貝識別位點的、缺乏識別位點的（或含識別位點突變的）pUC重組質粒DNA試劑、試劑盒 限制性內切核酸酶EcoRI及HhdIII1 mol L Tris ? Cl pH 7. 55 mmol L dCTPdGTPdTTPdATP5000 Ci mmol [α32P]
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
用位點識別DNA篩選λgtll表達文庫 用鹽酸胍進行干燥膜的變性/復性循環 從重組溶源菌中制備粗提物鑒定DNA結合蛋白的活性 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理
天然RNA文庫篩選與蛋白特異性結合的RNA序列實驗
實驗方法原理 細胞中，蛋白質與 RNA 結合參與多種生理調控和發育過程。在 mRNA 的加帽，多聚腺苷酸化，剪切，核外運，翻譯起始及降解等過程中都存在著蛋白質與 RNA 的直接相互作用。在發育的各個階段，RNA 結合蛋白可以通過與 mRNA 的相互作用調控基因的表達。實驗材料 mRNA寡核苷酸試劑、
天然RNA文庫篩選與蛋白特異性結合的RNA序列實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 細胞中，蛋白質與 RNA 結合參與多種生理調控和發育過程。在 mRNA 的加帽，多聚腺苷酸化，剪切，核外運，翻譯起始及降解等過程中都存在著蛋白質與 RNA 的直接相互作用。在發育的各個階段，RNA 結合蛋白可以通過與 m
天然RNA文庫篩選與蛋白特異性結合的RNA序列實驗
細胞中，蛋白質與 RNA 結合參與多種生理調控和發育過程。在 mRNA 的加帽，多聚腺苷酸化，剪切，核外運，翻譯起始及降解等過程中都存在著蛋白質與 RNA 的直接相互作用。在發育的各個階段，RNA 結合蛋白可以通過與 mRNA 的相互作用調控基因的表達。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗1
一個DNA位點識別探針被用來從表達文庫中檢測合適的重組克隆，并對 之進行純化，證明其中編碼了具有一定序列特異性的DNA結合域。這種策略排除了為 分離其基因而對序列特異性DNA結合蛋白進行純化的過程；只需要一個合適的構建于 λgtll載體中的cDNA文庫和一個DNA識別位點的探針。用位點識別DNA篩選
CDNA文庫篩選
CDNA文庫篩選（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2．將過夜培養物以3000×g離心5min。3．分別用2ml?λ-dil（10 mmol/L
CDNA文庫篩選
（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2．將過夜培養物以3000×g離心5min。3．分別用2ml?λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,
序列特異性DNA結合蛋白的親和層析純化實驗
DNA親和介質的制備 DNA偶聯于溴化氰活化的瓊脂糖上 用制備性凝膠電泳純化寡核苷酸 DNA親和層析法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理
序列特異性DNA結合蛋白的親和層析純化實驗
實驗方法原理 實驗材料 兩種帶有結合位點的合成寡核苷酸各440μg試劑、試劑盒 TE緩沖液 pH 7.810×T4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液20 mmol L ATP (鈉鹽） pH 7.0150 m Ci mL [γ-32P] ATP (6000 Ci mmol)10 U μL T4噬菌體多
cDNA的篩選2
（三）免疫篩選制備Sepharose偶聯細菌裂解液1.各用一個E.coli溫度敏感溶源菌株（BTA 282（λgt11amp3）或BNN 97）單菌落接種于2×7.5ml培養基并于32℃生長過夜。2.過夜培養物用LB培養基稀釋100倍，于32℃生長至OD600值為0.5。3.于45℃溫育15min誘
cDNA的篩選3
免疫學染色1.為了洗去頂層瓊脂上的殘余物和細胞碎片，將硝酸纖維素濾膜一次最多5張轉移放在搖床上的盤子（10×10cm）內，用25ml TBS室溫洗滌10 min 2次。2.然后濾膜用25ml封閉緩沖液（每張90mm直徑的濾膜至少15ml）于室溫溫育 30min，以封閉濾膜上的非特異性結合位點。不斷晃
cDNA的篩選1
（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1.用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2.將過夜培養物以3000×g離心5min。3.分別用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,
基因差異表達技術
真核生物中，從個體的生長、發育、衰老、死亡，到組織的得化、調亡以及細胞對各種生物、理化因子的應答，本質上都涉及基因的選擇性表達。高等生物大約有30000個不同的基因，但在生物體內任意8細胞中只有10%的基因的以表達，而這些基因的表達按特定的時間和空間順序有序地進行著，這種表達的方式即為基因的差異表達
常用的分子生物學基本技術1
DNA重組技術（或基因工程）是20世紀生物學的偉大成就，并已滲透到生命科學包括醫學 各個領域，為腫瘤的實驗研究和臨床診斷及治療提供了嶄新的技術和有用的工具。本附錄扼要介紹在分子腫瘤學領域中常用的分子生物學基本技術及其在腫瘤研究中的應用，著重介紹它們的原理和應用。至于具體的技術方法和操作步驟可參閱《分
常用的分子生物學基本技術（一）
核酸分子雜交技術由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術，被廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的