《科學》文章復活蛋白

來自北卡羅萊納州大學化學系，俄勒岡州大學生態與進化生物學中心的研究人員“復活”了4億5千萬年前的一個蛋白：脊椎動物糖皮質激素和鹽皮質激素受體（glucocorticoid (GR) and mineralocorticoid (MR) receptors），尋找引起這類受體進化的變化，這一研究成果公布在《Science》雜志上。

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Published Online August 16, 2007
Science DOI: 10.1126/science.1142819
Crystal Structure of an Ancient Protein: Evolution by Conformational Epistasis
[Abstract]

X射線結晶學是一門闡述蛋白質、DNA或其它生物分子的原子水平的三維結構的技術。這種方法的運用是基于首先使純化的生物分子結晶為有序排列然后用X射線分析結晶體。之所以使用X射線是因為其波長和原子裂解時的波長一樣，所以晶體作為分子衍射光柵衍射X射線，產生一種可以獲取并分析的衍射圖形。然后用計算機重建初始結構。在實際操作中這一衍射圖形被反復地不斷升高的分辨率處理，結晶學家不斷在建立一個模型結構并按該模型計算出的衍射圖形與實際觀察到的比較。每一次重復都使模型結構與實驗結果更加吻合。當這兩者之間的差異可以忽略時，這一衍射圖形便得到求解。最終的模型提供了被研究分子平均時間上的三維原子水平結構。蛋白靶子的X射線結晶體結構可以識別蛋白質的功能袋。當與自然或人工配體混合時，可以作為藥物設計的有用起始點。蛋白質X射線結構的目錄也為蛋白質結構類型、自然狀態下的折疊和域提供了有用信息。有時這被稱為結構基因組學。

幾年前，研究人員曾用重新構造遺傳序列以及用在活細胞中合成的方法，將一個4.5億年前的激素受體復活。現在科學家用這個復活蛋白祖先的晶體結構來尋找引起糖皮質激素受體進化的變化，糖皮質激素受體是該蛋白的一個現代后代。他們的研究為蛋白如何進化出新功能提供了獨特的視角。通過確定從祖先蛋白到現代糖皮質激素受體的一系列突變，Eric Ortlund和同事提出，幾個“允許”突變穩定了祖先蛋白一些位置的結構，為可能出現一些帶來不穩定的突變鋪平了道路，使受體得以與糖皮質激素結合。他們還發現，一個位置上的突變能影響其它不同位置的構象，擴大了第二個位置的新突變可能有用的可能性。

附：
蛋白質純化與結晶
獲得蛋白質的晶體結構的第一個瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質(>10 mg)，其濃度通常在10 mg/ml 以上，并以此為基礎進行結晶條件的篩選。運用重組基因的技術，將特定基因以選殖(clone)的方式嵌入表現載體(expression vector)內，此一載體通常具有易于調控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長的菌體中，如大腸桿菌(Escherichia coli)，在菌體快速生長的同時，也大量生產表現載體上的基因所解譯出之蛋白質。一般而言純度越高的蛋白質比較有機會形成晶體，因此純化蛋白質的步驟就成為一個重要的決定因素。

在取得高純度的蛋白質溶液后，接下來就是晶體的培養。蛋白質晶體與其他化合物晶體的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產生的，每一種蛋白質養晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學上的變量，如酸堿度、沈淀劑種類、離子濃度、蛋白質濃度等；物理上的變數，如溶液達成過飽和狀態的速率、溫度等；及生化上的變數，如蛋白質所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質的聚合狀態、等電點等，皆是養晶時的測試條件。截至目前為止，并無一套理論可以預測結晶的條件，所以必須不斷測試各種養晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體(圖一) 。

蛋白質晶體的培養，通常是利用氣相擴散法(Vapor Diffusion Method) 的原理來達成；也就是將含有高濃度的蛋白質(10-50 mg/ml)溶液加入適當的溶劑，慢慢降低蛋白質的溶解度，使其接近自發性的沈淀狀態時，蛋白質分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來說，我們將蛋白質溶于低濃度(~1.0 M) 的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度(~2.0 M)硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質溶液中硫酸銨的濃度，進而達成結晶的目的(圖二)。

蛋白質晶體在外觀上與其他晶體并無明顯不同之處，但在晶體的內部，卻有很大的差異。一般而言，蛋白質晶體除了蛋白質分子外，其他的空間則充滿約40 %至60 %之間的水溶液，其液態的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質分子在晶格排列上有不規則的情形出現，造成晶體處理時的困難及繞射數據上的搜集不易等缺點。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質分子在晶體內與水溶液中的狀態，極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質結構，基本上可視為自然狀態下的結構。

繞射數據的記錄
X 光繞射點搜集，隨著時間的推移，也由早期以閃爍計數器(scintillation counter) 一次記錄一個點及使用許多X-光片(X-ray film) 拍下繞射點，每張X 光片都要經過顯影的步驟；之后進而使用多重金屬絲板(multiwire)自動記錄每次偵測到的繞射點。目前使用的熒光記錄板(image plate)，則是利用磷化物經X 光激發后會產生熒光，經熒光掃描儀記錄成數字模式的圖像文件后，再以燈光照射一段時間去除記錄板上的熒光點，即可再進行下一次的記錄工作。電荷耦合器 (charge-coupled devices, CCD) 的出現及技術的改良，可以不斷地記錄繞射點，而不需熒光板掃描及去除步驟，如此將加速繞射點的搜集。目前的同步輻射光源幾乎全部使用CCD 來記錄繞射數據(圖三)。
在實驗室中的X 光光源的產生，一般使用銅作為旋轉式陽極靶(rotating anode)，可以產生波長為1.54 ? Cu Kα放射光。不過，以目前發表的文獻來看，在同步輻射(synchrotron)光源所搜集的資料有增加的趨勢，因為同步輻射所提供的X 光束，其強度較實驗室強約百倍、甚至上千倍，同時它也可以改變不同頻段的波長，以供非尋常散射(anomalous dispersion) 的實驗研究

繞射原理
單一分子在X 光下的訊號極弱，無法被記錄下來，然而在晶體中通常是由許多排列整齊的蛋白質分子所組成，當晶體內所有的分子(數量約在1015 個以上)一起在同一個方向上進行繞射且繞射波皆同步時，即足以使所產生的訊號被記錄下來。每一個繞射波的強度與其振幅(amplitude)的平方成正比。但繞射波的另一個變數，繞射波的相角(phase)，則無法直接測量得到，必須利用其他的方法方能獲得(見相角決定方法)。若是繞射點振幅與相角都可獲知，則可以進一步地來計算晶體中的電子密度圖。
下列方程式即是著名的傅立葉轉換公式，ρ表示在晶體中任何一個位置上(x, y, z) 的電子密度，φhkl 為繞射光相角，|Fhkl|為繞射光振幅，可由實驗測得的繞射光強度開平方獲得。
所以若是記錄了所有的繞射波的強度(h,k,l)，并計算出所有繞射光的相角，帶入這個公式，蛋白質在晶體內的結構，就以電子密度圖的方式呈現在我們的眼前了(圖四)。
相角決定方法
決定相角通常有三種常用的方法，分別是同型置換法(isomorphous replacement method) 、非尋常散射法(anomalous dispersion method) 以及分子置換法(molecular replacement) ，現在分述如下：
(1）同型置換法
同型重原子置換法最早的應用是在1954 年，用來解出血紅蛋白hemoglobin 的相角，需要在晶體蛋白質的內部加入重原子。通常以浸泡的方法使重原子能夠滲透(diffuse) 進入到晶體內部和蛋白質結合。這些重原子對X 光產生較大的繞射，對繞射點的強度會有明顯的差異，根據這些差異，可定出重原子的位置，并進而推算出蛋白質晶體繞射光的相角。理論上，若是只獲得一組重原子衍生物數據(single isomorphous replacement, SIR)，經計算后，其解并不是唯一的；因此通常會結合數個不同的重原子衍生物所得到的數據(multiple isomorphous replacement, MIR)， 來求得更精確的相角。
(2) 非尋常散射法
較重的原子會吸收特定波長的X 光，運用接近吸收邊緣(absorption edge)的X 光進行繞射實驗時，會產生不尋常的X 光散射或吸收現象，稱為非尋常散射(anomalous scattering)，此一現象可導致繞射振幅及相角的改變。經由數個不同波長的X 光照射，記錄吸收邊緣前后所產生的不同繞射結果，可依此計算出相角。由于它使用數個不同波長，所以稱為「多波長非尋常散射法」 (multiwavelength anomalous dispersion, MAD) 。使用這個方法的前提是X 光的波長需依重原子的特性加以調整，而一般在實驗室的X 光通常是屬于固定波長的，并無法滿足這個方法，所以非尋常散射法就需要利用同步輻射可變波長的光源來完成(5)。目前很多實驗室使用硒化甲硫胺酸 (selenomethionine)來取代甲硫胺酸 (methionine)，在養菌的同時加入硒化甲硫胺酸，使蛋白質的形成過程帶入含有重原子硒的硒化甲硫胺酸，接下來養出蛋白質晶體，在硒的吸收邊緣進行繞射實驗，并運用MAD 的方法來計算出蛋白質晶體繞射波的相角(圖四)。
(3) 分子置換法
若是一個未知的蛋白質與另一已解出結構的蛋白質，在胺基酸序列具有30 %以上的一致性(identity)，表示這兩個蛋白質的結構可能類似，可以利用分子置換法來計算出未知蛋白質的相角。利用已知蛋白質之結構分子帶入晶體中尋找旋轉及位移的可能位置，解析出結構。隨著蛋白質結構的增加，可以發現類似的蛋白質具有相同的折迭方式，而出現新的折迭的機率也相對減少，所以只要未知的蛋白質在蛋白質數據庫(Protein Data Bank, PDB )中，找到序列上具有同源性(homology)的已知結構時，即可在取得晶體繞射數據后，快速地運用分子置換法來解決相角問題。

三維結構模型之建立及修正
藉由電子密度圖的三維構形，可將每一個胺基酸依蛋白質序列建立蛋白質的起始模型。蛋白質的起始模型，常由于相角的解不夠完美，使計算出來的電子密度圖產生誤差，誤導模型的走向，因此需要做進一步的改善，稱為修正(refinement)。修正的目的在于進行立體化學(stereochemistry)(如勝鍵鍵長、鍵角、胺基酸構形)優化的同時，減少計算與實驗繞射點強度的差異，用來評估的數值則是「剩余值(R-factor)」：

其中 Fobs 及Fcalc 分別表示觀察值與計算值的繞射光振幅。盡可能將剩余值降到最低，直到進一步的修正無法減少其值為止，即達最終的蛋白質結構模型。大部分修正后可接受的剩余值約0.2 (20%)。但低的剩余值，并不代表其結構就是正確的。已有數個例子顯示在蛋白質結構上的某些部分不正確時，仍可能獲得較低的剩余值。因此Brünger (7)在1992 年提出一個交互驗證的程序，也就是取出部分的繞射點(建議為10%)，排除于修正的程序之外，以對結構的正確性，提供個別的檢查，稱為「自由剩余值(R- free) 」，其計算方式同剩余值。除了剩余值外，分辨率是另一個判斷晶體結構可信度的重要數值。分辨率在蛋白質晶體結構中通常是定義為：可以分辨二個平面的最小距離。分辨率對模型的建構所造成的影響，可以直接由電子密度圖看出，在低分辨率(~6 ? )時，只能觀察到由α螺旋(α-helix)所形成的圓柱形密度圖；隨著分辨率提高(3 ? ~ 2 ? ) ，主鏈與支鏈結構就會出現，但個別原子仍無法由密度圖中看出，除非分辨率可以達到1.0 ? 或更高的分辨率。蛋白質結構所能達到的分辨率，主要是取決晶體內分子排列的整齊程度。小分子晶體內并沒有太多的水分子，所以常能得到分辨率高于0.5 ? 的繞射數據。但因蛋白質結構由長的勝鏈所組成，其間又是由較弱的氫鍵及凡得瓦力所維系，造成蛋白質結構富有彈性，蛋白質分子與分子的堆棧也就沒有那么整齊。同時分子與分子之間的空隙由水分子來填補，也因這些空隙的水分子排列比較紊亂，所以蛋白質晶體繞射出的結果，僅有少數高分辨率晶體，一般蛋白質晶體結構的分辨率約在2.0 至3.0 ? 之間。