中科院：蠟樣芽孢桿菌降解孔雀石綠？蛋白組學分析機制

　　導讀

　　孔雀石綠（MG）作為一種染料的廣泛應用引起了人們的廣泛關注。蠟樣芽孢桿菌能對抗MG的毒性作用，并能有效地對MG進行脫色。然而，基于蛋白質組學數據的關于其潛在適應和降解機制的詳細信息卻很少。本研究采用等壓相對和絕對定量標記（iTRAQ）輔助定量方法，分析了蠟樣芽孢桿菌降解MG的分子機制。在此基礎上，在MG生物降解過程中，我們鑒定出209個上調蛋白和198個下調蛋白，錯誤發現率不超過1%。基因本體論和KEGG分析表明，差異表達的蛋白質在代謝過程、催化活性、抗氧化活性和對刺激的反應等方面都有豐富的表達。此外，利用實時qPCR進一步證實了參與苯甲酸降解的調控蛋白。參與苯甲酸降解途徑的蛋白質BCE_4076（乙酰輔酶A乙酰轉移酶）、BCE_5143（乙酰輔酶A乙酰轉移酶）、BCE_5144（3-羥酰基輔酶A脫氫酶）、BCE_4651（烯醇輔酶A水合酶）和BCE_5474（3-羥酰基輔酶A脫氫酶）可能在蠟樣芽孢桿菌對MG的生物降解中起重要作用。這項研究的結果不僅提供了蠟樣芽孢桿菌在MG負荷下蛋白質組學變化的綜合觀點，而且還揭示了蠟樣芽孢桿菌降解MG的機制。

　　論文ID

　　原名：iTRAQ-facilitated proteomic analysis of Bacillus cereus via degradation of malachite green

　　譯名：iTRAQ促進蠟樣芽孢桿菌降解孔雀石綠的蛋白質組學分析

　　期刊：Journal of Microbiology

　　IF：3.422

　　發表時間：2021.02

　　通訊作者：余志晟

　　通訊作者單位：中國科學院大學

　　實驗設計

　　1. 首先評估了不同濃度MG存在下蠟樣芽胞桿菌的生長速度；

　　2. iTRAQ蛋白質組學方法定量分析被用于鑒定蠟樣芽孢桿菌降解MG所涉及的蛋白質；

　　3. 利用MG脅迫下下調和上調的蛋白質進行了KEGG途徑分析；

　　4. 分析參與碳代謝和能量代謝的蛋白質、參與核苷酸修復和應激反應的蛋白質分析、谷胱甘肽代謝相關的蛋白至、苯甲酸酯降解過程中的蛋白質。

　　實驗結果

　　1. 生長速度和脫色效率

　　為了研究蠟樣芽胞桿菌生長速率的變化如何反映MG負荷反應，我們評估了不同濃度MG存在下蠟樣芽胞桿菌的生長。圖1總結了蠟樣芽胞桿菌在50、200和400 mg/LMG存在下的CFU和細胞生長曲線。用不同濃度的MG培養蠟樣芽胞桿菌表明，在低于400 mg/L的MG濃度下，蠟樣芽胞桿菌的菌落數達到106 CFU/mL，我們在這些細菌細胞之間沒有生長差異，如圖1A所示。然而，在400 mg/L的MG濃度下，蠟樣芽胞桿菌的菌落數達到104 CFU/mL。此外，蠟樣芽胞桿菌在不同MG濃度下的生長曲線進一步證實了菌落計數結果（圖1B）。這些結果表明，高濃度MG對蠟樣芽孢桿菌的生長有抑制作用。MG在許多微生物中的生長抑制已被證實，例如金黃色葡萄球菌、黃孢原毛平革菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母。MG的抑制作用歸因于抑制細菌DNA復制和增強細胞中的活性氧物種。在本研究中，400 mg/L的MG對蠟樣芽孢桿菌的生長有明顯的抑制作用。因此，雖然MG在低濃度下對蠟樣芽孢桿菌的生長沒有抑制作用，但為了維持正常生長，細菌受到了MG的遺傳毒性和細胞毒性的脅迫和損傷。由于比較同一培養階段的細菌蛋白質組很重要，因此我們選擇了對蠟樣芽孢桿菌生長無抑制作用的MG濃度（200 mg/L），并通過離心在對數后期收集所有用于iTRAQ分析的蛋白質樣品。

　　我們分析了蠟樣芽孢桿菌在不同MG濃度培養基中的脫色效率。盡管當染料濃度增加到400 mg/L時，染料的總脫色量急劇下降（圖1C），但隨著染料初始濃度的增加，MG的數量增加，Chen等人也報告了初始MG濃度增加時，去除的顏色量增加。這可能是由于較高的染料初始濃度可以增強驅動力，克服染料在細胞與MG之間的傳質阻力。

　　圖1 蠟樣芽孢桿菌在MG負荷下的生長及脫色效果

　　（A）蠟樣芽孢桿菌在LB瓊脂平板上不同MG濃度培養后的CFU譜。（B）蠟樣芽孢桿菌的生長曲線。（C）不同初始染料濃度對蠟樣芽孢桿菌脫色的影響。

　　2. 蠟樣芽孢桿菌iTRAQ定量蛋白功能分類研究

　　在這項研究中，iTRAQ蛋白質組學方法被用于鑒定蠟樣芽孢桿菌降解MG所涉及的蛋白質反應。皮爾遜相關性用于驗證生物復制品的分析再現性。我們在整個檢測范圍內獲得了一條變化很小的45度對角線，表明實驗具有高度的可重復性（參見補充數據圖S2）。在生物信息學分析中，我們將蛋白得分為1.3或更高作為閾值，從1725個獨特肽中鑒定出了407個差異調控蛋白（見補充數據表S2）。由iTRAQ蛋白質組學鑒定的蛋白質的長度和肽數的分布以及序列覆蓋率顯示在補充數據圖S3AC中。

　　407個差異表達蛋白中，209個表達上調，198個表達下調（iTRAQ比值1.5或0.667，P值均<0.05）。根據GO分析，這些調節蛋白根據細胞成分、生物過程和分子功能進行功能聚類，如圖2A C所示。在三個主要類別中，細胞成分類別的最大比例由細胞部分（72.3%）和大分子復合物（17%）表示；在生物過程類，代謝過程（70.8%）和細胞過程（17.3%）；分子功能類，蛋白質的催化活性（65.4%）和結合活性（19.1%）較高（圖2）。大量參與代謝過程和催化活性的蛋白質受到不同程度的上調或下調。此外，參與抗氧化活性和刺激反應的蛋白質均上調（圖2）。特別是，GO類代謝過程在MG負載樣品中包含33種上調的蛋白質物種，包括合成酶（PdxS、CarA、CarB、RibH、ArgJ、ArgG和MiaB）、連接酶（SucC、SucD、ArgS和GltX）以及H+轉運ATP酶亞基ε和γ。此外，MG負載樣品中五種脫氫酶（GuaB、Mdh、GcvPB、PdhA和RocA）的催化活性也增加，而三種脫氫酶（MtnB、IlvD和HisD）則降低。在抗氧化活性方面，谷胱甘肽過氧化物酶（BsaA）、有機過氧化氫抗性蛋白（BCE_）、烷基過氧化氫還原酶（AhpC和AhpF）表達上調3～7倍。在對刺激的反應中，黃血球蛋白（Hmp）、絲氨酸羥甲基轉移酶（GlyA）、ATP依賴性解旋酶/核酸酶亞單位A（AddA）和DNA錯配修復蛋白（MutS）等4種蛋白均增加。因此，MG負荷通過影響細胞生理的許多方面，包括新陳代謝、生理活動和應激反應，強烈地重塑了蠟樣芽孢桿菌的蛋白質組。

　　圖2 MG負荷下蠟樣芽孢桿菌差異表達蛋白的基因本體分析

　　（A）生物過程類的改變蛋白質；（B）細胞成分類的改變蛋白質；（C）分子功能類的改變蛋白質。

　　3. 通徑分析

　　為了更好地理解MG脅迫對細菌途徑的影響，我們利用MG脅迫下下調和上調的蛋白質進行了KEGG途徑分析（圖3）。在MG負荷下，45種蛋白與碳代謝有關，如糖酵解/糖異生、三羧酸循環（TCA）和丙酮酸代謝（表1）。相比之下，在MG處理的蠟樣芽孢桿菌細胞中，有13種下調的蛋白參與氨基酸代謝和生物合成，包括纈氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸和異亮氨酸代謝。此外，參與其他生物過程的蛋白（如脂肪酸代謝、肽聚糖生物合成和泛酸生物合成（表1））被下調。這些結果表明，MG以細胞應激的形式暴露，可以影響蠟樣芽胞桿菌的多種代謝途徑，這可能解釋了高濃度MG對蠟樣芽胞桿菌生長的抑制作用。值得注意的是，有5種上調蛋白（UvrA、Mfd、LigA、PcrA和PolA）與核苷酸切除修復有關，表明MG負載后可能存在DNA損傷，與DNA修復功能相關的蛋白在MG生物降解中起作用。因此，DNA修復蛋白的上調可能是蠟樣芽孢桿菌抵御MG負荷的一種保護機制，而MG脅迫下特異性代謝流量的降低可能是一種綜合性的抗MG策略。

　　圖3 基于KEGG富集分析的MG負荷下蠟樣芽孢桿菌差異表達蛋白的途徑分類

　　豐富因子，差異表達蛋白數量占相關通路總基因數量的比例。有超過5種蛋白質變化的途徑被顯示。

　　表1 部分差異表達蛋白及其在選定功能類別中的指定或假定功能

　　4. 參與碳代謝和能量代謝的蛋白質分析

　　與丙酮酸代謝和TCA相關的蛋白質在MG存在下在蠟樣芽孢桿菌中表現出增加的表達；這些蛋白質包括二氫硫酰脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復合物和乙酰輔酶A合成酶。此外，丙酮酸脫氫酶復合物（PDHC）是一種參與能量代謝的重要酶，在MG處理的樣品中表現出明顯的上調。PDHC是TCA的底物，它催化丙酮酸生成乙酰輔酶A。這一過程在從糖酵解到TCA的過程中起著至關重要的作用。此外，果糖1,6-二磷酸酶和丙酮酸羧化酶的增加表明糖異生作用增加。因此，這些結果表明，在MG脅迫下，參與碳代謝的蛋白質表達增加可能會增加碳骨架的產生或間接增加能量供應。此外，參與能量代謝的ATP合酶復合物的三個亞基ATP合酶β亞基（AtpC）和ATP合酶γ鏈（AtpH和AtpG）顯著上調。這些發現與觀察到的蠟樣芽孢桿菌在MG降解過程中碳水化合物代謝途徑成員的上調是一致的。Yi等人發現，在大腸桿菌工程菌株的三苯基錫生物降解過程中，ATP合成酶的三個亞基（AtpA、AtpD和AtpG）的表達顯著上調。此外，Szewczyk等人認為，能量相關蛋白表達的增加似乎是外源生物降解過程中的普遍結果。在本研究中，這三個ATP合酶亞基的上調表達表明蠟樣芽孢桿菌在MG生物降解過程中需要大量的能量。

　　5. 參與核苷酸修復和應激反應的蛋白質分析

　　在上述改變的蛋白中，許多核苷酸切除修復蛋白的表達增加。這可能是由于細胞內的代償機制，因為MG可以結合幾乎所有可用的DNA位點，并導致細菌DNA損傷。尤其是參與核苷酸切除修復和錯配修復的7種蛋白（UvrA、Mfd、LigA、PcrA、MutS、PolA和DnaX）上調3-8倍。其中，UvrA催化DNA損傷的識別和處理。LigA催化雙鏈DNA中5-磷酰基和3-羥基之間磷酸二酯鍵的形成，對DNA復制和受損DNA修復至關重要。DnaX負責大多數復制DNA合成；黃素血蛋白（Hmp）在對各種有毒氮化合物的誘導反應中起著核心作用。我們發現MG負荷組上調了1.82倍。此前，有報道稱，絲氨酸羥甲基轉移酶（GlyA）可提高大腸桿菌對高滲脅迫的耐受性，在200 mg/L的MG負荷組中，它被發現分別上調了2.21倍。值得注意的是，參與肽聚糖生物合成的三種蛋白質（DacF、MurD和BCE_2370）表達下調。肽聚糖在細菌中起結構作用，并抵消滲透壓。因此，在蠟樣芽孢桿菌中，高MG濃度和低肽聚糖生物合成可能會引起細胞的滲透脅迫，而上調GlyA可能是與MG相似的壓力反應策略。

　　6. 谷胱甘肽代謝相關蛋白的分析

　　紡織染料作為環境污染物在細胞氧化應激的產生中起著關鍵作用，并阻礙微生物的生長。結果表明，在蠟樣芽孢桿菌降解MG的過程中，谷胱甘肽過氧化物酶、氨酰組氨酸二肽酶、胞漿氨肽酶等與谷胱甘肽代謝有關的抗氧化酶表達上調。GSH是生物體內一種重要的抗氧化劑。它能清除多余的活性氧自由基，減輕細胞代謝過程中膜脂過氧化造成的損傷。先前的研究表明，GSH在降低MG的毒性作用中起著關鍵作用。在最近的一項研究中，Yildirim等人還證實，蚤狀鉤蝦中GSH、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-轉移酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平的增加提高了云芝對MG的脫色能力。這些發現表明細胞需要活性抗氧化蛋白來抵抗MG的毒性。GSH代謝相關蛋白的上調可能增強蠟樣芽孢桿菌抵御氧化應激和促進MG降解的能力。

　　7. 苯甲酸酯降解過程中的蛋白質分析

　　有兩種重要的機制被證明介導了三苯甲烷染料的降解。蠟樣芽孢桿菌能將MG降解為4,4-二（二甲氨基）二苯甲酮和另一種中間代謝物苯酚。這一過程類似于微球菌BD15對MG的降解。在微球菌菌株BD15中，4,4-雙（二甲氨基）-二苯甲酮被降解為N-二甲基苯胺和4-二甲氨基苯甲酸，然后進一步轉化為其他化合物進行降解。在這項研究中，與苯甲酸降解相關的蛋白質（BCE_5474、BCE_5144、BCE_4651、BCE_4076和BCE_5143)在蠟樣芽孢桿菌的MG生物降解過程中顯著上調。我們用RT-qPCR檢測200 mg/L MG脅迫下BCE_4651、BCE_5143、BCE_5144、BCE_4076和BCE_5474基因的表達水平（圖4A），并且這些結果與蛋白質組學結果一致。兩種分析都表明，這些基因的轉錄和翻譯水平在蠟樣芽孢桿菌降解MG的過程中顯著增加。因此，我們假設4，4-二（二甲氨基）二苯甲酮在蠟樣芽孢桿菌中轉化為苯甲酸鹽進一步降解。之后，苯甲酸降解的最終產物通過TCA進一步降解（圖4B）。Zhang等人也報道了苯甲酸鹽降解途徑富集在具有復雜苯環結構的染料活性黑5的降解中。基于上述蛋白質的數量和生物學功能，我們的研究結果表明苯甲酸降解途徑可能在蠟樣芽孢桿菌降解MG的過程中起重要作用。

　　基于目前的蛋白質組學研究結果和以往的文獻，我們提出了蠟樣芽孢桿菌對MG的潛在降解途徑，如圖5所示。蠟樣芽孢桿菌生物降解MG的初始步驟已在不同的研究中得到驗證。MG被氧化分解成4，4-二（二甲氨基）二苯甲酮和苯酚。芳香族聚合物降解的第二步是對芳香族化合物單體的分解代謝。然而，參與這些過程的蛋白質很少上調，這可能與該菌株對MG的固有高度脫色有關，因為蠟樣芽孢桿菌的粗酶具有降解MG的能力。在MG處理中，上調的主要蛋白參與了苯甲酸鹽降解途徑和TCA途徑。已提出不同菌株如假單胞菌、伯克霍爾德菌參與MG降解的TCA途徑。這項研究表明，苯甲酸降解途徑可能是負責進一步降解芳香化合物從MG。因此，本研究提出的蠟樣芽孢桿菌對MG的降解途徑為研究MG的生物降解機理提供了新的思路。

　　圖4 苯甲酸降解途徑在MG的降解過程中起著重要作用

　　（A）MG負荷下蠟樣芽孢桿菌苯甲酸降解相關基因的轉錄水平。結果代表三次實驗的平均值。誤差線表示一個標準差。（B）KEGG數據庫中顯示了從苯甲酸降解到檸檬酸循環的代謝流路徑模型。

　　圖5 根據蛋白質組學的研究結果和前人的研究成果所提出的蠟樣芽孢桿菌降解MG途徑

　　結論

　　總之，我們的研究在蠟樣芽胞桿菌中發現了一大類差異表達蛋白，這些差異表達蛋白參與了使用基于iTRAQ的LC-MS/MS降解MG的過程。這些差異表達蛋白參與了MG脅迫的保護、促進細菌生長以及在MG生物降解過程中最小化氧化應激。此外，我們發現在MG的降解過程中苯甲酸鹽的降解途徑增強。然而，需要進一步的研究來構建敲除突變體來驗證MG降解相關的基因功能。這些結果揭示了MG生物降解的第一個全面的蛋白質組，為MG生物降解的分子機制提供了新的見解。