使用熒光底物的直接ELISA實驗方案

實驗概要

使用熒光偶聯一抗的直接 ELISA 測定的程序。

實驗步驟

第 1 天：

1. 在濾過的 PBS 中稀釋包被抗體后，在每孔中加入 100 μl 進行包被。用封板膜覆蓋酶標板，將酶標板在 4℃下孵育過夜。

第 2 天：

2. 將 4 g Block ACE 粉末稀釋于 100 ml 去離子水中，使用其 1:4 稀釋液在每孔中加入 200 μl，在室溫下封閉酶標板 3 小時，封閉期間用封板膜覆蓋酶標板。

3. 洗滌酶標板：PBS-T (0.05% Tween20) 250 μl/孔；3x 30 s。

4. 取 100 μl 剛剛在 10% BlockACE 的 PBS-T 溶液中稀釋的標準品或樣品，上樣到酶標板，并在 4℃下孵育過夜，孵育期間用封板膜覆蓋酶標板。

第 3 天：

5. 以 100 μl/孔的量添加稀釋于 PBS 中的生物素化報告抗體，在室溫下孵育 2 小時，孵育期間用封板膜覆蓋酶標板。

6. 以 100 μl/孔的量添加以 1:5000 稀釋于 PBS 中的鏈霉親和素堿性磷酸酶，在室溫下孵育 1 小時，孵育期間用封板膜覆蓋酶標板。

7. 洗滌酶標板：TBS 250 μl/孔；3x 30 s。

8. 以 100 μl/孔的量添加 AttoPhos 熒光底物系統，在室溫下孵育 5-10 分鐘，使信號放大。使用前應將 36 mg AttoPhos 底物與 60 ml AttoPhos 緩沖液混合 24 小時。確保孔干凈無污染。

9. 在熒光計（Perkin Elmer 生產的 Victor2）上測定信號；激發波長：440 nm；發射波長：550 nm。