免疫膠體金的制備及其在醫學檢驗中的應用

　　摘要免疫膠體金技術是四大免疫標記技術之一，問世二十多年來發展十分迅速，在生物醫學各研究領域特別是在醫學檢驗中得到了日益廣泛的應用。本文從膠體金技術的基本原理、制備方法、標記技術和實際應用等幾個方面對膠體金技術作了較系統介紹。

　　1971年Faulk 和Taytor將膠體金引人免疫化學，此后免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。目前在醫學檢驗中的應用主要是免疫層析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(D ot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于檢測 HBsAg 、HCG 和抗雙鏈ＤＮＡ抗體等，具有簡單、快速、準確和無污染等優點。

　　免疫膠體金技術的基本原理 　　
　　氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。

　　免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。

　　膠體金的制備方法 　　　　
　　膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。下面介紹最常用的制備方法及注意事項。
　　１、玻璃容器的清潔：玻璃表面少量的污染會干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃容器應絕對清潔，用前經過酸洗、硅化。硅化過程一般是將玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。專用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩定其表面，棄去后以雙蒸餾水淋洗，可代替硅化處理。
　　２、試劑、水質和環境：氯金酸極易吸潮，對金屬有強烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其１％水溶液在４℃可穩定數月不變。實驗用水一般用雙蒸餾水。實驗室中的塵粒要盡量減少，否則實驗的結果將缺乏重復性。
　　金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發生改變，應選用緩沖容量足夠大的緩沖系統，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3～5.8) 、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5～10.3)等緩沖系統。但應注意不應使緩沖液濃度過高而使金溶膠自凝。
　　３、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠：

　　取0.01％氯金酸水溶液100ml 加熱至沸，攪動下準確加入１％檸檬酸三鈉水溶液 0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在２分鐘內變為紫紅色，繼續煮沸１５分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區最高吸收峰在 535nm，Ａ1cm/535=1.12。 金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關，一旦顆粒大小發生變化，光散射也隨之發生變異，產生肉眼可見的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱免疫凝集試驗的基礎。

　　金溶膠顆粒的直徑和制備時加入的檸檬酸三鈉量是密切相關的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見附表。 附表 100 ml 氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響１％檸檬酸三鈉ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00金溶膠顏色藍灰、紫灰、紫紅、紅、橙紅、橙吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518徑粒(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15　

　　４、檸檬酸三鈉－鞣酸混合還原劑：用此混合還原劑可以得到比較滿意的金溶膠，操作方法如下：取 4ml１％檸檬酸三鈉 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml 25mmo/L K2CO2（體積與鞣酸加入量相等），以雙蒸餾水補至溶液最終體積為20ml，加熱至60℃取1ml１％的 HAuCl4，加于79ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60℃，然后迅速將上述檸檬酸－鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.5～1小時)后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰５分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。

　　５、白磷還原法：在120ml雙蒸餾水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一飽和度的白磷乙醚溶液，混勻后室溫放置15分鐘，在回流下煮沸直至紅褐色轉變為紅色。此法制得的膠體金直徑約 6nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實驗室不宜采用。

　　要得到大小更均勻的膠體金顆粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度離心，經分級后制得膠體金顆粒直徑的變異系數（ＣＶ）可小于１５％。

　　免疫膠體金制備
　　１、蛋白質的處理：由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應先對低離子強度的水透析。必須注意，蛋白質溶液應絕對澄清無細小微粒，否則應先用微孔濾膜或超速離心除去。
　　一般情況下應避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因為它們都可吸附于顆粒表面而減弱膠體金對蛋白質的吸附。
　　２、蛋白質最適用量的選擇：將待標記的蛋白質儲存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質5～40ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設一管不加蛋白質的對照管，５分鐘后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置２小時，不穩定的金溶膠將發生聚沉，能使膠體金穩定的最適蛋白量再加10％即為最佳標記蛋白量。
　　３、標記：在接近并略為高于蛋白質等電點的條件下標記是比較合適的，在此情況下蛋白質分子在金顆粒表面的吸附量最大。
　　下述標記步驟最為常見：
　　①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調節金溶膠至所需pH(標記ＳＰＡ時調到pH6.0)。　　②于100ml 金溶膠中加入最佳標記量的蛋白質溶液（體積為２～３ml），攪拌２～３分鐘。　　③加入5ml１％PEG20000溶液。　　④于10000～100000g離心30～60分鐘（根據粒徑大小選擇不同離心條件），小心吸去上清液（切忌傾倒）。　　⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復，濃度以 Ａ1cm/540nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4℃保存。　　⑥包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進行凝膠層析分離純化，以含 0.1％ＢＳＡ的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以Ａ蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0。　　以上操作中應注意，一切溶液中不應含雜質微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。

　　膠體金的穩定性及免疫膠體金的貯存
　　膠體金具有很高的動力學穩定性，在穩定因素不受破壞時自身凝聚極慢，可放置數年不發生凝聚。影響穩定的因素主要有電解質、溶膠濃度、溫度、非電解質等。
　　金溶膠必須有少量電解質作穩定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質能剝去膠粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質反而可增加溶膠穩定性，如蛋白質、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩定效果。
　　當金溶膠吸附蛋白質后，溶膠的穩定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質的等電點，如ConA，過氧化物酶等，當pH較低時保持穩定，提高pH則顯得不穩定，接近等電點或略高時又變得穩定了。標記后的膠體金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作為穩定劑。在4～10℃貯存數月有效，不宜冰凍。貯存中可能會發生程度不同的凝聚，可離心除去。

　　免疫膠體金的應用　　
　　１、膠體金在電鏡水平的應用
　　膠體金應用電鏡水平的研究最早，發展最快，應用最廣泛。其最大優點是可以通過應用不同大小的顆粒或結合酶標進行雙重或多重標記。直徑為3～15nm 膠體金均可用作電鏡水平的標記物。3～15nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測，而直徑15nm 多用于檢測量較多的感染細胞。
　　膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：①細胞懸液或單層培養中細胞表面抗原的觀察。②單層培養中細胞內抗原的檢測。③組織抗原的檢測。
　　金標記在電鏡水平的應用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負染色、雙標記技術和原位雜交技術等。
　　實驗證明，該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、操作簡單、敏感性和特異性高，既可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測，因此，可同時適用于科研和診斷。
　　２、膠體金在光鏡水平的應用
　　膠體金同樣可用做光鏡水平的標記物，取代傳統的熒光素、酶等。各種細胞涂片、切片均可應用。主要用于：①用單克窿抗體或抗血清檢測細胞懸液或培養的單層細胞的膜表面抗原。②檢測培養的單層細胞胞內抗原，③組織中或亞薄切片中抗原的檢測。　　膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補其它標記物不可避免的本底過高和內部酶活性干擾等缺點。
　　３、膠體金在流式細胞儀中的應用：　　應用熒光素標記的抗體，通過流式細胞儀計數分析細胞表面抗原，是免疫學研究中的重要技術之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊，區分不同的標記困難，因此必須尋找一種非熒光素標記物，用于流式細胞計數。這樣可以同時進行幾種標記。該標記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，因而可以作為流式細胞儀的標記物之一。
　　４、凝集試驗：單分散的免疫金溶膠呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當與相應抗原或抗體發生專一性反應后出現凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發生變化，顆粒也會沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，這一原理可定性或定量地應用于免疫反應。
　　５、免疫印跡技術(immunoblotting)：免疫印跡是一種較新的免疫化學技術。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質分離，得到的區帶轉移至硝酸纖維素膜，然后用酶免疫法（或免疫熒光、ＲＩＡ）進行定量。

　　免疫膠體金也可用于該法的定量。轉移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后，再與經葡萄球菌Ａ蛋白致敏的膠體金溫育，徹底洗去多余的膠體金，根據膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。　　利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強金顆粒的可見性，更可大大提高測定靈敏度，檢測下限可低至 0.1ng，這種免疫金銀染色法應用已日趨廣泛。　　由于膠體金免疫印跡技術簡便、快速，且有相當的高的靈敏度，在臨床免疫診斷上有很大的應用潛力。

　　６、膠體金在肉眼水平的應用　　膠體金取代傳統三大標記物，用于肉眼水平的免疫檢測中。除了膠體金本身具有的特點外，還有以下優點：①試劑和樣本用量極小，樣本量可低至1～2ul；②不需γ－計數器、熒光顯微鏡、酶標檢測儀等貴重儀器，更適于現場應用；③沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質參與；④實驗結果可以長期保存；⑤時間大大縮短，提高了檢測速度。

　　金標過程中，無共價鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質都可被金標記，標記后大分子物質活性不發生改變。實驗結果表明，膠體金的敏感性可達到 ELISA的水平。而結合銀染色時，檢測的敏感性更大大提高。　　　

　　膠體金在免疫層析快速診斷技術中的應用
　　免疫層析法(immunochromatography)是近幾年來國外興起的一種快速診斷技術，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的免疫診斷。　　
　　 早孕診斷用的免疫層析試紙條（通常又叫尿妊紙條）的裝配結構見圖一。

　　裝配方法：在塑料底板上分別將吸尿用玻璃纖維、凍干金標記抗α－HCG玻璃纖維、已固定有抗β－HCG抗體的NC膜及硬質吸水濾紙按圖裝配，配件與塑料底板的結合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為4mm的條狀，即為尿妊用紙條。

　　本法檢測速度快，一般一兩分鐘可出結果；靈敏度高，可達50IU/L；好的試紙條結果也是準確可靠的，這是其所以能在尿妊診斷中得到廣泛應用的主要原因。尿妊試紙條的快速特性來源于膠體金免疫層析法的固有特性，但與原材料選擇特別是NC膜的孔徑大小密切相關，準確性取決于抗β－HC G的特異性。

　　金標尿妊紙條雖然好用，但在使用中也必須注意以下幾個方面：一是溫度，試紙條雖然可在室溫保存，但大批暫時不用的試紙條還是應該放在４℃保存，以免抗體失效，從冰箱剛取出的試紙條則應待其恢復至室溫，然后才打開密封，可避免反應線模糊不清。二是正確操作，一般的操作方法是在試紙條的吸尿玻璃端滴入２滴（約１００微升）尿液，或將吸尿端直接插入標本中，深度約１０～１５毫米２０秒，取出后平放，這種方法比較麻煩且容易造成污染。我們的方法是取尿標本約0.5ml 加入小試管中，然后插入試紙條，待１～２分鐘反應帶清晰后觀察結果。

　　 膠體金在快速斑點滲濾技術中的應用
　　ＥＬＩＳＡ法在臨床實驗室已得到普遍的應用，特別是用于各型肝炎標志物的檢測。但ＥＬＩＳＡ法由于操作程序復雜，時間較長，給實驗室帶來不便。因此出現一步法快速檢測試劑盒，雖可提高檢測速度，但有出現假陰性結果的弊端。ＥＬＩＳＡ法需時較長的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗體）需經擴散才能與固相上的抗原或抗體反應不適當地縮短反應時間，將使靈敏度降至臨床要求以下。為滿足臨床快速檢測的需要，近年來發展了多種簡便、快速的免疫學檢測方法，快速斑點滲濾法即為其中一種，其標記物質用膠體金即稱為快速斑點免疫金滲濾法(Dot-immunogold filt ration assay)，又稱滴金免疫法。

　　快速斑點滲濾法的基本原理仍是間接法或夾心法。間接法測抗體：固定于膜上的特異性抗原＋標本中的相應抗體＋金標記的抗抗體或ＳＰＡ顯色。夾心法測抗原：固定于膜上的多克隆抗體＋標本中待測抗原＋金標記的特異性單克隆抗體顯色。

　　結果判斷：快速斑點免疫金滲濾法在操作完成后即可直接觀察結果。根據測定模式的不同可有以下不同的判定結果。

　　快速斑點免疫金滲濾法檢測速度快，結果觀察一目了然，已應用于多種臨床檢測項目。
　　以上分析可以看出，膠體金標記技術是繼三大標記技術之后，又一較為成熟且已得到廣泛應用的免疫標記技術。