免疫膠體金技術介紹

一、免疫膠體金技術的基本知識

1、膠體金的概念

氯金酸(HAuCl₄)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。

2、免疫金標記技術

膠體金顆粒表面負電荷與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。膠體金對蛋白質有很強的吸附功能，蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面，無共價鍵形成，標記后大分子物質活性不發生改變。

3、膠體金的示蹤原理

金顆粒具有高電子密度的特性。金標蛋白在相應的配體處大量聚集時，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒或肉眼可見紅色或粉紅色斑點。

免疫金銀染色：利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀這一原理，通過銀顆粒的沉積，在光鏡下可見抗原抗體反應的陽性部位呈現銀的黑褐色。

二、膠體金的制備

1、膠體金制備的注意事項

（1）玻璃容器的清潔：玻璃容器應絕對清潔，用前酸洗、硅化。

（2）試劑、水質：實驗用水一般用雙蒸水。緩沖液有足夠大的緩沖容量，濃度不應過高以免金溶膠自凝。

2、常用方法

一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、白磷。

（1）檸檬酸三鈉還原法：

取0.01％氯金酸水溶液100 ml加熱至沸，攪動下準確加入１％檸檬酸三鈉水溶液0.7 ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內變為紫紅色，繼續煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區最高吸收峰在535 nm，Ａ1 cm/535 nm=1.12。

100 ml氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響：

１％檸檬酸三鈉（ml ）0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00

金溶膠顏色                   藍灰 紫灰  紫紅 紅   橙紅  橙

吸收峰(nm)                    220   240    535   525   522   518

徑粒(nm)                        147   97.5   71.5   41   24.5   15

（2）檸檬酸三鈉－鞣酸混合還原劑：改變鞣酸的加入量，制得不同大小的膠體顆粒。

（3）白磷還原法：制備的膠體金直徑約6 nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實驗室不宜采用。

三、免疫膠體金的制備

1、制備膠體金標記蛋白質應注意的問題

（1）蛋白質的預處理。蛋白質應先對低離子強度的水透析，去除鹽類成分。用微孔濾膜或超速離心除去蛋白質溶液中的細小微粒。

（2）低鹽濃度的緩沖液。過量鹽可使金顆粒發生凝集。

（3）PH接近于蛋白質等電點或略偏堿性。蛋白質所處溶解狀態最適合偶聯，蛋白質分子在金顆粒表面的吸附量最大。

（4）蛋白質最適用量的選擇：能使膠體金穩定的最適蛋白量再加10％即為最佳標記蛋白量。

（5）膠體金與蛋白質偶聯后，加入穩定劑，以避免產生凝集。一般選用PEG（分子量為20000）和牛血清白蛋白作穩定劑。

2、常見方法

（1）用0.1 mol/L K₂CO₃或0.1 mol/L HCl調節金溶膠至所需pH。

（2）加入最佳標記量的蛋白質溶液，攪拌2～3分鐘。

（3）加入5 ml 1％PEG20000 溶液。

（4）于10000～100000 g離心，小心吸去上清液。

（5）將沉淀懸浮于一定的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復，濃度以Ａ1 cm/540 nm=1.5左右為宜，置4 ℃保存。

四、免疫膠體金的應用

1、膠體金在光鏡水平、電鏡水平的應用

直徑為3～15 nm膠體金均可用作電鏡水平的標記物。最大優點是可以通過應用不同大小的顆粒進行雙重或多重標記。

膠體金用于光鏡水平、電鏡水平的研究，主要包括：①細胞懸液或單層培養中細胞表面抗原的觀察。②單層培養中細胞內抗原的檢測。③組織切片中抗原的檢測。

2、膠體金在流式細胞儀中的應用

應用膠體金標記的抗體，分析細胞表面抗原。膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，區分不同的標記，能同時進行幾種標記。

3、凝集試驗

單分散的免疫金溶膠清澈透明。與相應抗原或抗體發生專一性反應后出現凝聚，溶膠顆粒增大、沉降，光散射隨之發生變化，溶液的顏色發生變化。

4、免疫印跡技術

用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質分離，得到的區帶轉移至硝酸纖維素膜，與特異性的抗體保溫后，再與膠體金標記物溫育，根據膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。金免疫印跡技術有相當高的靈敏度。采用免疫金銀染色法，靈敏度可低至0.1 ng。

5、膠體金在肉眼水平的應用--膠體金免疫結合試驗