免疫膠體金技術2

（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。

（4）氯金酸的質量要求上乘，雜質少。最好是進口的。

（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持數月穩定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解。

（三） 膠體金標記蛋白的制備

膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質的等電點時，則會聚集而失去結合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質的分子量等都影響膠體金與蛋白質的結合。

1．待標記蛋白溶液的制備 將待標記蛋白預先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。

2．待標膠體金溶液的準備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調膠體金液的pH值。標記IgG時，調至9.0；標記McAb時,調至8.2；標記親和層析抗體時，調至7.6；標記SPA時，調至 5.9～6.2；標記ConA時，調至8.0；標記親和素時，調至9～10。

由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調節pH時，采用精密pH試紙測定為宜。

3．膠體金與標記蛋白用量之比的確定

（1）根據待標記蛋白的要求，將膠體金調好pH之后，分裝10管，每管1ml。

（2）將標記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5μg/ml～50μg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。

（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結果。

（4）結果觀察，對照管（未加蛋白質）和加入蛋白質的量不足以穩定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍的聚沉現象；而加入蛋白量達到或超過最低穩定量的各管仍保持紅色不變。以穩定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質用量，即為該標記蛋白質的最低用量，在實際工作中，可適當增加10％～20％。

4．膠體金與蛋白質（IgG）的結合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調 pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續攪拌10min，加入一定量的穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。常用穩定劑是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1％；1％聚乙二醇加至總溶液的1／10。

5．膠體金標記蛋白的純化

（1）超速離心法：根據膠體金顆粒的大小，標記蛋白的種類及穩定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。

用BSA做穩定劑的膠體金—羊抗兔IgG結合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結合物用6 000g，4℃離心1h；20nm～40nm膠體金結合物，14 000g，4℃離心1h。仔細吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN3），將沉淀重懸為原體積的 1／10，4℃保存。如在結合物內加50％甘油可貯存于-18℃保存一年以上。