凱氏定氮法的實驗原理

　　一、實驗原理
　蛋白質是含氮的有機化合物。蛋白質與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液 滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，蛋白質含量。含氮量*6.25=蛋白含量
　　1.有機物中的胺根在強熱和CuSO4，濃H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4

凱氏定氮法
凱氏定氮法反應式為：
　　2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化劑）
　　2.在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反應式為:
　　(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4

　　2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

　　3. 用已知濃度的H2SO4（或HCI）標準溶液滴定，根據HCI消耗的量計算出氮的含量，然后乘以相應的換算因子，既得蛋白質的含量

　　反應式為：

　　(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3

　　(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

　
　　　二、操作
　　　1、 樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網上，小火加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸同一方法做試劑空白試驗。但是此法比較危險，不易在實驗室演示，現在大多數實驗室有消煮儀一次可以進行多個（一次可以消煮16個樣品）樣品處理，并有通風櫥進行通風，溫度可以自己設定，更加安全和可操作性，因此逐步成為主要的凱氏定氮法的首選處理方法。
　　一般消解溫度都設在240度及240度以上，如果想快速消解可以適當提高溫度甚至可以用最大溫度進行消解。
　　2、按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅 指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。
　　3、向接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，不能立即將玻璃蓋塞緊，這樣易使玻璃塞粘在進樣口，應先用蒸餾水沖洗然后再蓋，并加水于小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N鹽酸標準溶液定至灰色或藍紫色為終點。
　　同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。
　　
　　三、計算　　
　　X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
　　X：樣品中蛋白質的百分含量，g；
　　V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積，ml；
　　V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積，ml；
　　N：硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度；
　　0.014：1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當于氮克數；
　　m：樣品的質量（體積），g（ml）；
　　F：氮換算為蛋白質的系數 。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳制品為6.38，面粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其制品為5.71，肉與肉制品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為 5.30。