大滿貫！2019年施一公團隊連續發表Cell，Nature，Science文章

　　2015年，通過單粒子冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）分析確定剪接體的第一個近原子分辨率結構，報道了來自S. pombe的ILS復合物。從那時起，已經闡明了13種冷凍-EM結構，大部分分辨率在3.3和5.8之間，已經闡明了來自釀酒酵母的組裝剪接體的七種不同狀態，人類剪接體的7種不同狀態的11種這樣的結構。在剪接體的八種已知功能狀態中，僅B *復合物在結構上保持未表征。

　　2019年3月14日，施一公研究組在Cell在線發表題為“Structures of the Catalytically Activated Yeast Spliceosome Reveal the Mechanism of Branching”的研究論文，該研究得到了釀酒酵母的兩種不同前mRNA上組裝了B *復合物，并確定了四種不同B *復合物的冷凍EM結構，總分辨率為2.9-3.8?。

　　U2核小RNA（snRNA）和分支點序列（BPS）之間的雙鏈離散地遠離5個B *復合物中的5'-剪接位點（5'SS），其缺乏步驟I剪接因子Yju2和Cwc25。 將Yju2募集到活性位點使U2 / BPS雙鏈體進入5'SS附近，BPS親核試劑位于距催化金屬M24?處。 該分析揭示了Yju2和Cwc25在分支中的功能機制。 不同前mRNA上的這些結構揭示了在主要功能狀態下剪接體的底物特異性構象。 這些構象狀態的比較揭示了對支化反應的機理見解。

　　2019年1月11日，清華大學施一公團隊在Science在線發表題為“Recognition of the amyloid precursor protein by human γ-secretase”的研究論文，該論文報告了人類γ-分泌酶與跨膜APP片段的復合物的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，分辨率達到2.6?。 APP的跨膜螺旋（TM）與PS1的五個周圍TM（γ-分泌酶的催化亞基）緊密相互作用。 該結構與結合Notch的γ-分泌酶的結構一起揭示了底物結合的對比特征，其可用于設計底物特異性抑制劑。因此，該結構用作發現γ-分泌酶的底物特異性抑制劑和理解γ-分泌酶的生物學功能以及AD的疾病機制的重要框架。

　　2019年1月1日，施一公研究組在Nature在線發表題為“Structural basis of Notch recognition by human γ-secretase”的研究論文，該論文報告人類γ-分泌酶與Notch片段的復合物的冷凍電子顯微鏡結構，分辨率為2.7?。 Notch的跨膜螺旋被PS1的三個跨膜結構域包圍，并且Notch片段的羧基末端β-鏈形成β-折疊，其在細胞內側具有兩個底物誘導的PS1的β-鏈。 雜合β-折疊的形成對于底物裂解是必需的，其發生在Notch跨膜螺旋的羧基末端。 PS1在底物結合后經歷明顯的構象重排。 這些特征揭示了Notch識別的結構基礎，并且對γ-分泌酶對淀粉樣蛋白前體蛋白的募集具有意義。

　　在1977年，Phillip Sharp和Richard Roberts倆個研究組獨立發現了剪切這一過程，緊接著，1979年， Steitz研究組發現五種稱為U1，U2，U4，U5和U6 snRNA的富含尿苷的小核RNA（snRNA）和7種12-35kDa的蛋白質（snRNPs）。之后， Steitz等研究組發現U1 snRNA的5'末端序列被識別為與5'剪接位點（5'SS）互補，并且snRNP被部分純化。純化的U1snRNP在體外特異性結合到5'SS上，并且U1snRNP的消耗抑制了體外剪接。隨后，證實了多個snRNPs參與前mRNA剪接。

施一公

　　剪接測定的發展使得剪切反應的描繪成為可能。 發現ATP和鎂（Mg2 +）對于腺病毒前體mRNA的體外剪接是必不可少的。 通過分支點序列（BPS）中的腺苷核苷酸和5'SS的5'末端的鳥嘌呤核苷酸之間的連接形成內含子套索結構，得到了生物化學證實。

　　前體mRNA剪接是由剪接體催化的，剪接體是一種高度動態和復雜的分子機器，它含有前體mRNA，U1，U2，U4 / U6和U5 snRNPs以及許多非snRNP蛋白。 U1和U2 snRNP分別與內含子的5'剪接位點（ss）和分支位點（BS）相互作用，同時為U4 / U6.U5 tri-snRNP的穩定整合鋪平了道路，產生了剪接體B復合物。然而，盡管tri-snRNP引入了必需的催化組分，但是剪接體B復合物仍然需要轉化成催化活性復合物，這一過程需要廣泛的結構重排。通過解開U4 snRNA的U4 / U6雙鏈體（通過RNA解旋酶Brr2）啟動活化， U6隨后與U2（U2 / U6螺旋Ia和螺旋Ib）以及內部莖環（U6 ISL）自由地形成短雙鏈體。最終在剪接體激活期間建立的催化RNA-RNA網絡與II組自我剪接內含子的催化核心非常相似。

剪切過程

　　隨后通過RNA解旋酶PRP2將所得的活化的但是預催化的B（Bact）復合物轉化為催化剪接體（命名為B *）。在人類中，B-to-B *轉換也需要AQR RNA解旋酶的ATP酶活性，這在酵母釀酒酵母的剪接體中是不存在的。這表明人類剪接體中催化活化所需的構象重排比酵母中的那些更復雜。 B *復合物催化剪切的第一步，產生切割的5'外顯子和內含子3'外顯子套索中間體，產生剪接體C復合物。額外的RNP重排將C復合物轉化為C *復合物，然后催化第二步剪接，并且5'和3'外顯子的連接形成mRNA并釋放內含子作為套索。

來自釀酒酵母的催化活化的剪接體（B *復合物）的冷凍電子顯微鏡結構

　　2015年，通過單粒子冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）分析確定剪接體的第一個近原子分辨率結構，報道了來自S. pombe的ILS復合物。從那時起，已經闡明了13種冷凍-EM結構，大部分分辨率在3.3和5.8之間，已經闡明了來自釀酒酵母的組裝剪接體的七種不同狀態，人類剪接體的7種不同狀態的11種這樣的結構。在剪接體的八種已知功能狀態中，僅B *復合物在結構上保持未表征。

釀酒酵母B *復合物中的RNA元件

　　在這項研究中，研究人員報告了來自釀酒酵母的B *復合物的冷凍-EM結構。該研究得到了釀酒酵母的兩種不同前mRNA上組裝了B *復合物，并確定了四種不同B *復合物的冷凍EM結構，總分辨率為2.9-3.8?。 U2核小RNA（snRNA）和分支點序列（BPS）之間的雙鏈離散地遠離5個B *復合物中的5'-剪接位點（5'SS），其缺乏步驟I剪接因子Yju2和Cwc25。 將Yju2募集到活性位點使U2 / BPS雙鏈體進入5'SS附近，BPS親核試劑位于距催化金屬M24?處。

結構總結

　　該分析揭示了Yju2和Cwc25在分支中的功能機制。 不同前mRNA上的這些結構揭示了在主要功能狀態下剪接體的底物特異性構象。這些構象狀態的比較揭示了對支化反應的機理見解。