揭示USP9X去泛素化ALDH1A3并維持GCSs的間充質特性

　　膠質母細胞瘤（GBM）是最常見和破壞性的人腦惡性腫瘤，其特征在于廣泛的腫瘤內異質性。盡管最近在多模式治療方面取得了進展，但GBM患者的結果仍然令人沮喪。GBM擁有一個細胞亞群，稱為GBM干細胞（GSCs），具有自我更新活性和多向分化潛能以及腫瘤起始能力。因此，迫切需要探索針對GSC的新治療策略。并且，醛脫氫酶（ALDH）超家族包含19種酶，它們將內源和外源醛代謝成相應的羧酸。ALDH1A3是主要的ALDH同工酶，參與人體細胞的各種生理過程。越來越多的證據表明，ALDH1A3在癌癥干細胞（CSCs）中表現出高活性，并影響這些細胞內的各種生物學特征。在GBM中，已發現ALDH1A3作為維持間充質（MES）GSC的自我更新和致瘤性的關鍵分子。然而，MES GSCs中ALDH1A3失調的機制仍然是神秘的。

　　2019年4月8日，南京醫科大學第一附屬醫院王慧博團隊等人在The Journal of Clinical Investigation上發表題為“USP9X deubiquitinates ALDH1A3and maintains mesenchymal identity in glioblastoma stem cells”的文章，發現USP9X是一種真正的DUB，可調節ALDH1A3多泛素化和穩定化。并且，USP9X是預測ALDH1A3hi MES GSCs富集的關鍵分子，是MES GSCs自我更新和致瘤性所必需的。同時還評估了USP9X抑制對患者來源的MES GSC異種移植模型的潛在治療效果。

　　為了確定ALDH1A3蛋白是否被泛素  -蛋白酶體系統（UPS）翻譯后控制，研究人員首先使用放線菌酮（CHX）阻斷蛋白質從頭合成并追蹤HEK293T細胞和正常人星形膠質細胞（NHAs）中的ALDH1A3蛋白質水平。實際上，ALDH1A3在CHX處理的8小時內逐漸降解并幾乎檢測不到。此外，用蛋白酶體抑制劑MG-132處理細胞導致ALDH1A3蛋白水平顯著增加。這些數據表明ALDH1A3通過UPS降解。接下來，研究人員尋求鑒定負責ALDH1A3穩定化的潛在DUB，并使用靶向HEK293T細胞中的98DUB的siGENOMERTF文庫進行RNAi篩選。

　　該研究初始篩選鑒定了與ALDH1A3表達相關的4個DUB（USP3，USP9X，USP22和OTUD1）。當這些DUB與HEK293細胞中的ALDH1A3共表達時，發現只有USP9X能夠與內源性ALDH1A3直接相互作用，從而暗示USP9X是控制ALDH1A3穩定性的顯著候選物。為了測試這一點，將Flag標記的WT USP9X或催化失活的突變體C1566A USP9X（在催化結構域的一個關鍵半胱氨酸中攜帶點突變）轉染到HEK293T細胞中。 WT USP9X而非C1566A突變體的表達以劑量依賴性方式增加ALDH1A3蛋白水平，表明USP9X以依賴于其DUB活性的方式調節ALDH1A3。

　　膠質母細胞瘤（GBM）干細胞（GSC）的間充質（MES）亞型代表癌細胞亞群，其因其高度侵襲性和對常規療法的抗性而聞名。最近已提出醛脫氫酶1A3（ALDH1A3）作為維持GSC的MES特征的關鍵決定因素。然而，支持異常ALDH1A3表達的機制仍然難以捉摸。在該研究中，研究人員發現泛素特異性蛋白酶9X（USP9X）是MES GSC中ALDH1A3的真正去泛素化酶。 USP9X與ALDH1A3相互作用，解聚并穩定化。

　　此外，研究結果顯示FACS分選的USP9Xhi細胞富集具有高ALDH1A3活性和有效致瘤能力的MES GSC。USP9X的消耗顯著下調ALDH1A3，導致MES GSC的自我更新和致瘤能力的喪失，這可以通過ALDH1A3的異位表達得到很大程度的挽救。此外，研究人員還證明USP9X抑制劑WP1130誘導ALDH1A3降解并且在MES GSC衍生的原位異種移植模型中顯示出顯著的治療功效。另外，USP9X與原發性人GBM樣品中的ALDH1A3表達強烈相關，并且對于具有MES亞組的患者具有預后價值。總的來說，研究結果揭示了USP9X作為ALDH1A3蛋白穩定化的關鍵去泛素化酶和GSC定向治療的潛在靶點。