模板DNA的準備、實驗的組織和PCR擴增實驗

PCR 緩沖液ddH20基因組 DNAdNTP寡核苷酸引物

離心機和轉子丙烯酸防護板過濾阻擋吸頭多道移液器PCR 儀托盤 固定器裝置底座管蓋小管

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

含 15 mmol/LMgCl₂ 的 10XPCR 緩沖液 (GeneAmpPCR 緩沖液 I，AppliedBiosystems)

滅過菌的 ddH₂0

2. 酶和酶緩沖液

TaqDNA 聚合酶，(AppliedBiosystems 或 Invitrogen)

3. 核酸和寡核苷酸

基因組 DNA

10 mmol/L dNTP(GeneAmpPCRdNTP 混合物，AppliedBiosystems)

寡核苷酸引物（Invitrogen 公司合成，稀釋成 lOumol/L)

4. 離心機和轉子

用翻轉吊桶式轉子和微板適配器離心

5. 專用設備

丙烯酸防護板（acrylicshield)

過濾阻擋吸頭（filterbarriertips)

多道移液器（Eppendorf 或 ApogentDiscoveries)

PCR 儀，96 孔（AppliedBiosystemsGeneAmp9700)

托盤/固定器裝置和底座，96 孔（AppliedBiosystems)

管蓋，一條 8 個（USAScientific 或 AppliedBiosystems)

小管，0.2 ml，一條 8 個（USAScientific 或 AppliedBiosystems)

二、方法

1. 在冰上融化 dNTP、10XPCR 緩沖液和未標記的引物。Taq 酶在加入反應混合物之前應保存在-20°C。在丙烯酸防護板后融化標記的引物。

2. 每一個反應的混合物包括：

滅菌 ddH₂0                                       6.95ul

含 MgCl₂ 的 10XPCR 緩沖液            1.25ul

10mmol/LdNTP                                  0.25ul

10mmol/L 未標記引物                        0.5ul

標記引物                                            0.5ul

在優化實驗條件過程中，如果 PCR 產物的放射信號強度太低，可以增加標記引物的用量，同時按相應

比例調整 ddH₂0 的體積。

TaqDNA 聚合酶（終濃度為 0.25U)     0.05ul

對于一個 96 孔微孔板，準備用于 100 個反應的混合物。

3. 混勻，按等份加入放置在冰上的 PCR 板中（9.5ul/樣品）。

4. 用多道移液器加入 3ulDNA(60ng)，混勻。

5. 把蓋子蓋緊，將板放入預熱到 94°C 的 PCR 儀中。

6. 如果產物大小是 200bp, 擴增 30 個循環。循環參數如下：94°C 初始變性 5 min;30個循環的 94°C 變性 30s; 根據經驗確定的退火溫度（Tm) 退火 30s;72°C 延伸 30s。最后一步 72°C 延伸 7 min。值可以通過引物序列計算出來，公式為 2(A+T)+4(G+C)。

7. 擴增完成后，將樣品于-20°C 凍存，或者直接進入方案 3。