用CRISPR構建誘導性基因敲除人類干細胞系

　　來自威斯康星大學的研究人員報告稱，他們開發出了一種新策略來快速構建誘導性基因敲除（iKO）人類多能干細胞（hPSC）系。相關研究論文發布在7月2日的《細胞干細胞》（Cell stem cell）雜志上

　　威斯康星大學的張素春（Su-Chun Zhang）教授及助理研究員Yuejun Chen是這篇論文的共同通訊作者。張素春教授是著名的WiCell研究所創始人之一。他的實驗室主要研究胚胎干細胞（尤其是人胚胎干細胞）的神經分化，是該領域做的最好的實驗室。他的貢獻包括曾在國際上首次將人胚胎干細胞分化成神經前體細胞，將胚胎干細胞分化成各種類型神經元及膠質細胞，研究關鍵基因（如Pax6等）在神經系統發育中的作用等。

　　hPSCs（包括胚胎干細胞（hESCs）和人類誘導多能干細胞(hiPSCs)），具有生成機體內所有的細胞類型。因而當前被人們廣泛地用于構建基于細胞的體外疾病模型，化學篩查和細胞治療。然而直到現在，構建出可誘導基因敲除的hPSC細胞系仍然是一個極大的挑戰。

　　CRISPR/Cas9系統是近年來興起的一種強大的基因組編輯工具，這一系統是通過細菌的II型規律成簇的間隔短回文重復(CRISPR)序列和它自身一種非常高效的Cas9核酸酶，來靶向目的基因造成特異的雙鏈斷裂(DSBs)而有效地引起基因組改變或突變。目前,CRISPR/Cas9系統已被用于hESCs和hiPSCs的基因修飾穩定株的制備,還用于大鼠,線蟲,斑馬魚等基因敲除動物模型的構建（延伸閱讀：CRISPR先驅Science發表新成果 ）。

　　條件性基因敲除/敲入是指在特定的組織或細胞發育的特定階段敲除或敲入某一特定的基因，對于研究特定基因在特定組織及特定時間的功能具有重要意義。當前研究人員主要是通過Cre／10xP或者Ftp／FRT重組系統來實現條件性基因敲除或敲入。這兩個系統都是位點特異性重組酶系統，已發展成為在體內、外進行遺傳操作的有力工具。這兩個系統的應用，可以使靶基因的表達或缺失發生在試驗動物發育的某一階段或某一特定的組織器官。

　　在這篇Cell stem cell文章中，張素春教授和他的研究小組探討了聯合CRISPR/Cas9介導的基因組編輯和Flp/FRT及Cre/LoxP系統來構建iKO hPSC細胞系。他們發現“雙sgRNA尋靶”是實現FRT精確雙等位基因敲入的必要條件。他們進一步開發了一種策略，可在插入一種活性可控的表達重組酶的基因盒（cassette）的同時除去耐藥基因，由此加快了生成iKO hPSC細胞系的速度。研究人員利用這種兩步策略構建出了SOX2、PAX6、OTX2和AGO2誘導性基因敲除的hESC和iPSC細胞系。

　　作者們表示，利用這種新策略來獲得iKO hPSC細胞系，將大大改變我們在人類細胞中探究基因功能的方式。