PCR 法
斑點雜交法
Southern 雜交法
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | 貼壁生長良好的單層 BS-C-1 或 HuTK-143B 細胞 重組病毒噬斑懸液 |
| 試劑、試劑盒 | PBS 胰酶／EDTA 干冰／乙醇 DNA 提取緩沖液 乙酸鈉 乙醇 PCR 擴增緩沖液 引物 完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培養基 完全 MEM-10／BrdU 培養基 篩選試劑 4 dNTP 混合物 MgCl2 |
| 儀器、耗材 | 24 孔組織培養板 杯狀超聲儀 |
| 實驗步驟 |
實驗試劑準備詳見「其他」。 1. 吸出匯片生長單層細胞的培養基。 1.1 對于 XGPRT 篩選，用 BS-C-1 細胞。 1.2 對于 TK 篩選，用 HuTK-143B 細胞。 2. 用 37℃ 的 PBS 或胰酶/EDTA 洗細胞 1 次，以除去剩余血清。 3. 用剛好覆蓋單層細胞、37℃ 的胰酶/EDTA（對于 150 cm2 培養瓶需要 1.5 ml）覆蓋細胞。消化 30 s （細胞應該分開），晃動培養瓶使細胞完全分開。 4. 加入 8.5 ml 適當培養基。 4.1 對于 BS-C-1 細胞，使用完全 MEM-10 培養基 4.2 對于 HuTK-143B 細胞，使用完全 MEM-10/BrdU 培養基。吸打細胞懸液數次使團塊散開。 5. 用血球計數器對細胞進行計數。 6. 將 1.25 ×105 細胞/孔放入 24 孔組織培養板培養（每孔終體積為 0.5 ml），至細胞匯片（應小于 24 h）。 7. 將小管中的病毒置于冰水上，在杯狀超聲儀上以最大功率超聲 20~30 s。 8. 吸出組織培養板中的培養基，用一個重組病毒噬斑感染一個孔的細胞，一般用噬斑懸液的一半體積（如有0.5 ml 的噬斑懸液用 0.25 ml），溫育 1~2 h，期間每隔 15~30 min，輕輕搖晃培養瓶。 9. 加入 1 ml 含適當篩選試劑的完全 MEM-2.5 培養基，培養直到細胞病變（細胞變圓）明顯（一般 24~48 h）。 9.1 對于 XGPRT 篩選，加入 1/400 體積的 10 mg/ml MPA、1/40 體積的 10 mg/ml 黃嘌呤、1/670 體積的 10 mg/ml 次黃嘌呤。 9.2 對于 TK 篩選，加入 1/200 體積的 5 mg/ml BrdU。 10. 用細胞刮刀輕輕刮下細胞，轉移到離心管中，最大轉速離心 30 s。棄培養基；再加入 1 ml PBS，渦旋混勻，最大轉速離心 30 s 棄 PBS，用 0.5 ml PBS 重懸。 11. 反復凍融法裂解細胞懸液：用干冰/乙醇冷凍細胞，再將細胞放入 37℃ 水浴鍋，且渦旋解凍。如此進行 3 次。 12. 將重懸的細胞懸液置于冰水混合物上，在杯狀超聲儀上以最大功率超聲 20~30 s。 13. 取 50~100 μl 細胞懸液移至微量離心管中。加入 1/10 體積的 DNA 提取緩沖液，輕輕翻轉數次使其混合，37℃ 放置 2 h 至過夜。 14. 用等體積的平衡苯酚抽提 1 次，再用等體積的氯仿抽提 1 次。 15. 加入 1/10 體積 pH 6.0，3 mol/L 的乙酸鈉（終體積為 0.3 mol/L）和 1.5 體積 95% 的乙醇。 -20℃ 放置 20 min。 16. 4℃ 以最大轉速離心 15 min，棄上清。用冰浴的 70% 乙醇洗滌，空氣中晾干。 17. 用 20 μl 去離子水溶解沉淀。在冰上配制下列反應混合物： 10 μl 溶解的模板 DNA 5 μl 10 × 無 MgCl2 的 PCR 擴增緩沖液 5 μl 10 mmol/L 4 dNTP 混合物 5 μl 100 μmol/L 引物 5 μl 15 mmol/L MgCl2 24.5 μl H2O 覆蓋上礦物油。 此步驟使用高保真的 PCR 試劑盒（BoehringerMannheim）更好。 18. 用下列熱循環參數進行 PCR 反應。 35 個循環：20 s 95℃ （變性） 20 s 55～60℃ （復性） 1~2 min 72℃ （延伸） 1個循環：5 min 72℃ （延伸） 最后一步：無限時 4℃ （保存） 此條件適合擴增 1 kb 大小的片段。 19. 瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產物。
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| 注意事項 |
1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養箱中培養，除非有特殊說明。 2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須無菌。
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| 其他 |
試劑： 磷酸緩沖液（PBS） 胰酶/EDTA（0.25%:0.02%），37℃ 完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培養基 完全 MEM-10/BrdU 培養基 篩選試劑（過濾除菌，-20℃ 保存）： 10 mg/ml（400×）麥考酚酸（MPA；Calbiochem），溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 篩選）； 10 mg/ml（40×）黃嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 篩選）； 10 mg/ml（670×）次黃嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH（XGPRT 篩選）； 5 mg/ml（200×）5-溴脫氧尿苷（BrdU），溶于水（TK 篩選） 干冰/乙醇 DNA 提取緩沖液 3 mol/L 乙酸鈉，pH 6.0 95% 和 70% 冰浴的乙醇 10 × 無 MgCl2 的 PCR 擴增緩沖液 10 mmol/L 4 dNTP 混合物 100 μmol/L 引物（序列按照插入的外源基因的位點設計） 15 mmol/L MgCl2
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