盤點單分子蛋白分析的新興工具

　　阿爾茨海默癥和帕金森癥這樣的神經退行性疾病，都是由微小的毒性蛋白寡聚體引起的。現在，新興的單分子技術正在幫助人們研究這些蛋白聚合物，為相關疾病的治療帶來新的希望。

　　阿爾茨海默癥被認為是β淀粉樣蛋白發生錯誤折疊引起的。這些蛋白在神經元中累積形成了大量的淀粉樣纖維和蛋白斑塊，不僅影響了大腦的記憶功能，還威脅著神經元的生命。

　　然而最近有新證據指出，阿爾茨海默癥實際上是少數蛋白在疾病早期聚集的結果。這些蛋白形成了可溶性的淀粉樣蛋白寡聚體，而那些長纖維和斑塊實際上起的是保護作用，將有毒性的寡聚體隔離起來。

　　“我們希望能夠在疾病的初始階段研究單分子的相互作用，解析它們形成毒性寡聚體的過程，并找到阻止疾病發展的途徑，”滑鐵盧大學的副教授Zoya Leonenko說。

　　“留聲機”

　　研究小分子及其相互作用的方法很多，Leonenko選擇了原子力顯微鏡（AFM）。“AFM是一個理想的工具，可以獲得單分子水平上的高分辨率圖像，幫助我們解析淀粉樣蛋白的寡聚體形成，”她解釋道。

　　Leonenko介紹道，AFM的高分辨率依賴于一個微小的探針，該探針就像留聲機上的唱針，在樣本表面掃過并同時讀取信息。研究人員先令淀粉樣蛋白在溶液中聚集，然后將寡聚體放在云母片上進行研究。這種云母的表面非常平滑，以至于探針可以根據其表面的粗糙程度，區分未結合的蛋白單體。

　　Leonenko的研究團隊不僅利用AFM研究淀粉樣蛋白的聚集和毒性機制，還希望依靠這一技術進行藥物開發。為此，他們將AFM與原子力光譜AFS結合了起來。

　　在進行AFS分析時，研究人員先將一個β淀粉樣蛋白單體放置在云母片上，然后給AFM探針帶上另一個β淀粉樣蛋白單體。在探針接觸云母表面時，探針的單體會接觸并結合云母上的蛋白單體。這時研究人員縮回探針，將兩個結合的分子拉開，同時檢測蛋白單體分開所需的力（即蛋白聚集的結合力）。

　　“如果在其中加入阻止蛋白單體結合的藥物，就能夠在單分子水平上檢測這種藥物的有效性，”Leonenko說。她補充道，與目前的其他藥物篩選方法相比，這一方案能夠顯著降低成本和工作量。單分子測試所需的藥物量更少，而且AFS能夠在幾個小時內完成數百種不同條件和輔助因子的篩選。

　　“縫紉機”

　　Lancaster大學的Oleg Kolosov選擇了另一種方法來進行阿爾茨海默癥研究，超聲波原子力顯微鏡UFM（ultrasonic force microscopy）。

　　與AFM相同的是，UFM也使用一個探針。不過該技術利用高頻震動，可以在探針移動的同時滑動樣本，就像是一臺縫紉機。

　　這種方法依賴反差對β淀粉樣蛋白的聚合物進行成像。電鏡中的反差來自于染色，而UFM的反差來自于微觀力學性能上的差異。Kolosov選擇了PLL（多聚-L-賴氨酸）作為背景，它不僅允許UFM區分出β淀粉樣蛋白，還能將蛋白粘在片層上。

　　Kolosov通過改良版的UFM跟蹤分析了β淀粉樣蛋白的聚積過程，發現即使形成了蛋白纖維，毒性寡聚體依然存在。這說明還有許多寡聚體沒有參與蛋白的累積過程。下一步，Kolosov打算進一步改良技術以便在液體中進行檢測，這樣就可以在生理環境下實時監控蛋白的聚積過程。

　　“小鑷子”

　　Alberta大學的Michael Woodside通過被稱為光鑷的單分子技術，研究了α-突觸核蛋白形成寡聚體的過程，這種蛋白是帕金森癥的致病蛋白。

　　Woodside的研究團隊分別構建了一個、兩個和四個拷貝的α-突觸核蛋白，拷貝之間以linker間隔。隨后他們在上述結構的兩端添加了DNA把手，一端標記上digoxigenin，一端標記上生物素。最后用抗digoxigenin和抗生物素的聚苯乙烯珠與DNA把手結合，形成啞鈴結構。

　　光鑷的激光束能夠將微珠固定，文章的第一作者Krishna Neupane解釋道，“我們用兩股激光分別固定兩端的微珠，然后拉開激光束，向蛋白施加拉力。”這時微珠的位置反映了蛋白寡聚體中的結構改變。

　　這一技術可以為研究人員展示蛋白寡聚體的結構多樣性。實際上由于光鑷非常敏感，這項研究揭示了更多的寡聚體構造。不過研究人員強調，這些數據只是體現了蛋白折疊的可能性，活體內是否存在上述結構還有待于進一步證實。

　　Neupane正在用這一技術研究家族性帕金森癥的相關突變蛋白。他計劃進一步構建六聚體和八聚體蛋白，以便分析更大的聚合物。

　　上述研究展示了致病蛋白剛開始聚集時的具體過程。在這些單分子分析技術的幫助下，相信不久人們就能解析寡聚體或蛋白纖維的形成過程，以及它們的毒性機制。目前，單分子研究的成果已經為相關疾病研究的發展提供了堅實的基礎。Neupane、Leonenko和Kolosov已經開始篩選能夠改變寡聚化和蛋白累積的藥物。

　　 “對于阿爾茨海默癥和帕金森癥這樣的疾病來說，將生物醫學與單分子分析聯系起來非常重要，可以幫助人們取得疾病防治的重大進展，”Leonenko說。