納米孔測序“僵尸數據”困境破局！復旦大學聯合新華醫院推出LongBow算法

納米孔測序技術憑借其長讀長、可直接檢測堿基修飾以及實時測序等優勢，正在深刻改變生命科學與醫學研究的格局。然而，在目前公開的超70萬組數據中，約85%因缺乏關鍵元數據——特別是測序芯片類型與堿基識別配置信息——而成為難以有效利用的"僵尸數據"。

近日，上海交通大學醫學院附屬新華醫院與復旦大學合作開發的LongBow算法成功破解了這一技術難題。該創新算法僅需通過FASTQ文件中的質量值（QV）即可精準還原測序芯片類型與堿基識別配置信息。經多類樣本測試驗證，LongBow的識別準確率超過95%。研究團隊還同步構建了配套數據庫LongBowDB，為科研人員提供高效的數據查詢支持。此外，LongBow還有效解決了納米孔測序相關研究的可重復性危機，填補了納米孔測序數據再利用的關鍵技術空白。該工具為基于納米孔測序的大數據研究打下了堅實的基礎。 

相對于傳統的短讀長二代測序，納米孔測序具有長讀長、能直接檢測堿基修飾、以及實時測序等眾多優勢，對生命科學與醫學研究帶來了革命性的影響。隨著納米孔測序技術近年來的廣泛應用，公共數據庫中已經累計了大量數據，僅SRA數據庫中就有超過70萬組數據發表。若能有效整合這些數據，將極大的推動基因組學、表觀遺傳學、醫學基因檢測、以及生物醫學AI大模型的發展。然而令人遺憾的是，由于關鍵元數據的缺失，大多數（約85%）的公開納米孔測序數據都是難以直接利用的“僵尸數據”。

納米孔測序中最基礎也是最容易被忽略的元數據就是測序芯片類型（flowcell type）以及堿基識別（basecaller）算法的配置信息，其中包括堿基識別軟件的版本以及堿基識別模式等參數。由于這些元數據會對測序數據的錯誤率以及錯誤模式產生重大影響，因此絕大多數下游分析軟件，如變異檢測、基因組組裝、以及單倍型分型等，都需要直接或間接的將芯片類型與堿基識別算法的配置信息作為輸入（表1）。如果使用錯誤的參數進行分析，可能會導致準確率下降高達50%（圖1d-g）。 

表1. 需要將芯片類型與堿基識別算法的配置信息作為輸入的常用軟件

圖1. 測序芯片類型與堿基識別算法的配置信息對下游分析算法有重大影響，但是大多數公開納米孔測序數據都缺少這些信息。

針對上述問題，本文作者提出了一種名為LongBow（Lucid Dorado and Guppy Basecaller configuration predictor）的算法，能夠根據FASTQ文件中堿基質量分數（QV）準確預測納米孔測序的關鍵元數據——測序芯片類型與堿基識別算法配置信息。LongBow是一種層級啟發式的算法，只使用FASTQ文件中的測序質量值（QV）作為輸入，使用三層分類模型分別還原測序信息的不同部分（圖2）。在LongBow模型中，第一層使用QV值的最大值區分目前主流的兩種堿基識別軟件（Guppy/Dorado）；第二層使用QV值的百分比分布特征預測出相應的測序芯片版本(R9/R10)和堿基識別軟件的版本（例如Guppy4，Guppy6）；在第三層中使用QV值的自相關性精細區分具體的堿基識別模式(FAST/HAC/SUP)。

圖2. LongBow的工作原理與流程

本文作者基于44個物種的66組納米孔測序數據進行了測試。獨立測試集涵蓋動物、植物、細菌和病毒等不同生物類群，并包含基因組DNA、游離DNA、細胞器DNA及宏基因組等多種測序類型。結果表明，LongBow在這些多樣化數據集上的準確率可達95.33%。作者還在1989組關聯文章報道了測序芯片類型與堿基識別算法配置信息的人類納米孔測序數據上進行了測試，LongBow的預測結果與文章報道的一致性為91.45%。此外，作者還利用LongBow對SRA數據庫中所有人類納米孔測序數據進行了預測，并基于預測結果構建了LongBowDB數據庫（圖3），為研究人員提供便捷的查詢服務。

圖3. LongBowDB界面

除了會影響納米孔測序的大數據挖掘以外，公開數據與文獻中缺少測序芯片類型與堿基識別算法配置信息還影響了相關研究的可靠性與可重復性，造成了嚴重的可重復性危機。嚴格意義上講，所有缺少測序芯片類型與堿基識別算法配置信息的研究工作都是不可重復的。作者發現COG-UK項目涉及了超過10萬組新冠病毒基因組納米孔測序數據，其中絕大多數數據未披露測序芯片與堿基識別算法配置信息，因此相關研究工作報道的結果是無法從原始測序數據開始重復的。作者按照COG-UK文章中的算法與代碼，隨機填寫測序芯片與堿基識別算法配置信息，結果發現基因組變異檢測的準確率下降了近10%，完全無法重復文章報道的結果。然而，使用LongBow預測的結果作為輸入，則能夠得到與原文相近的準確率。

綜上所述，LongBow作為一種創新的大數據挖掘基礎算法，通過從納米孔測序數據的FASTQ文件中提取堿基質量值（QV）模式，高效準確地推斷出關鍵的元數據——測序芯片類型（如R9/R10）和堿基識別器配置（如Guppy/Dorado），解決了當前大規模挖掘納米孔測序數據的痛點問題。其創新性體現在：1）首次實現了無需原始測序日志即可還原分析必需參數，突破了大規模納米孔測序數據深度挖掘的技術瓶頸；2）配套開發的LongBowDB數據庫為SRA中所有人源納米孔測序數據提供便捷查詢服務，顯著提升了數據復用性；3）在COG-UK新冠病毒測序項目中的實踐表明，基于LongBow的變異檢測能發現更多功能重要的基因組變異，直接解決了納米孔測序研究中的可重復性問題。該工具為群體基因組學、病原體監測和進化研究提供了不可或缺的分析基礎。

復旦大學生命科學學院博士生孟子鈞和上海交通大學醫學院附屬新華醫院陳文雋為本文共同第一作者。上海交通大學醫學院附屬新華醫院馮智星、余永國、孫錕教授與復旦大學生命科學學院馮會娟青年研究員為本文的共同通訊作者。

論文原文：Mencius, J., Chen, W., Zheng, Y.et al. Restoring flowcell type and basecaller configuration from FASTQ files of nanopore sequencing data. Nat Commun 16, 4102 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-59378-x