腫瘤細胞侵襲實驗

Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養基中重建形成膜結構，這種膜結構與天然基質膜結構極為相似。

濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內情況較為相似。

鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養液或人睪丸上皮成纖維細胞培養液，上室加入重懸的瘤細胞，具有侵襲能力的細胞在趨化劑誘導下開始穿膜運動。細胞穿膜所用的時間與Martrigel的用量有關，選擇 25ugMartrigell鋪膜，16小時后觀察結果較為合適。穿過濾膜的細胞多數粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統計穿過Martrigel的細胞數。另外用Transwell小室也可進行重建基質膜侵襲分析，這一方法是在 Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細胞72h后觀察結果。值得注意的是，細胞在TransWll腔中培養 72小時后，有相當數量穿過濾膜的細胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進人下腔溶液中．因此統計穿過基質膜的細胞數目時應把這部分細胞考慮在內。腫瘤細胞穿過重建基質膜的能力與它的體內侵襲轉移能力表現出較好的相關性，可以用重建基質膜模型初篩抗侵襲藥物。

在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細胞通過變形運動穿過濾膜，用這種模型對分析細胞運動能力和藥物對細胞運動能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對腫瘤細胞的趨化性或趨固性的影響。

Matrigel 基質膠

DMEM 結晶紫染料溶液 醋酸 低血清DMEM培養基 FBS-DMEM培養基 IFN-γ

24-transwell (Coster) 離心管 冰箱 離心機 移液槍 槍頭 槍頭盒

一、準備

1.  溶膠，4℃過夜。

2.  室溫下基質膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗前-20C預冷。

二、 包被基底膜（冰上操作）

1.  用無血清的冷細胞培養基DMEM稀釋Matrigel膠。

2.  取100 ul稀釋膠加到24-well transwell上室中。

3.  37℃孵育transwell至少4-5 h 。

三、 水化基底膜

1.  用無血清培養基輕洗凝膠 。

四、準備細胞懸液和小室

1.  消化法從細胞培養瓶中獲取細胞。

2.  用培養基洗3遍。

3.  重懸細胞，5×10⁵cells/ml，1% FBS 。

4.  上室加200 ul細胞懸液。

5.  下室中加入600 ul細胞培養基，含有5 ug/ml fibronectin作為黏連亞族。

五、 孵育

37℃，20 - 24 h 。

六、 染色和計數

1.  棉簽擦去上室上面的非侵襲細胞。

2.  移去transwells，倒置，風干。

3.  24孔板中加入500 μl含0.1%結晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒在培養基中，37℃ 30min后取出，PBS清洗。

4.  直徑上取4個視野，照相，計數。

5.  24孔板中加入500 μl 33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩10 min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上570nm測OD值，間接反應細胞數。

1.  照相前一定要晾干，照相時將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察、照相。

2.  使用 Matrivgel前應從-20℃轉移至4℃待其自然溶化（如過夜放置），避免反復凍融。

3.  使用時需接觸 Matrivgel的試管、移液吸頭等均應預冷于4℃。

4.  使用 Matrivgel時注意無菌操作。

溶液配制

1.  DMEM

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml）

（2）母液0.1 ml（5 mg）+ ddH2O up to 5 ml ；過濾消毒，-20℃保存。

2.  NE-DMEM（-6 M）

NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

DMEM UP TO 100 ml

過濾消毒，4℃保存

3.  NE+CGRP-DMEM（-6 M，100 ng）

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

（2）CGRP-儲存液 50 μl

（3）DMEM UP TO 100 ml

（4）過濾消毒，4℃保存

4.  NE+IFN-DMEM（-6 M，50 ng）

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

（2）IFN-γ（25ng/μl） 25 μl

（3）DMEM UP TO 100 ml

（4）過濾消毒，4℃保存。

5.  低血清DMEM培養基（上室）

6.  20%FBS-DMEM培養基（下室）

7.  Matrigel 基質膠

（1）10 mg/ml，5 ml，分裝成0.5 ml/只10個EP管中。

（2）用時加入0.5 ml的DMEM。

（3）Matrivgel在冰上維持液態，室溫時可迅速凝結成膠。