蛋白質濃度測定（雙縮脲法）

實驗原理

測定蛋白質的定量方法有很多，目前常用的有凱氏定氮法；比色法主要包括雙縮脲法、Folin-酚試劑法及 染料結合法；紫外分光光度法等

雙縮脲(Biuret)法：在堿性溶液中，雙縮脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡合物，這一反應稱雙縮脲反應。凡分子中含二個或二個以上酰胺基(—CO—NH2)，或與此相似的基團[如—CH2—NH2，—CS—NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發生上述反應。蛋白質分子含有眾多肽鍵(—CO—NH—)，可發生雙縮脲反應，且呈色強度在一定濃度范圍內與肽鍵數量即與蛋白質含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。與同樣處理的蛋白標準液比較，經計算或查標準曲線即可求出血清總蛋白質含量。

實驗試劑

1．6mol/L氫氧化鈉溶液  
      稱取氫氧化鈉(NaOH，優級純)240g，用新鮮蒸餾水配制成1L，置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。
2．雙縮脲試劑  
      稱取未失結晶水的硫酸銅(CuSQ·5H20) 3.0g，溶于500m1新鮮蒸餾水中，加酒石酸鉀鈉(NaKC₄H₄O₆.4H₂O)9.0g，碘化鉀(KI)5.0g，待安全
      溶解后，加入6mol/L氫氧化鈉溶液100ml，zui后加蒸餾水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里，約穩定6個月。
3．蛋白標準液 
      可用商品血清蛋白標準液或定值質控血清為標準。亦可收集混合新鮮血清，用凱氏定氮法標定后，加疊氮鈉防腐(疊氮鈉的終濃0.5~1.0g/L)，冰凍
      保存。

實驗設備

        恒溫水浴箱、722（721）分光光度計、吸管、試管、坐標紙

實驗步驟

1.   配制20g／L蛋白標準液  如蛋白標準液濃度為70g／L，則取此液2m1，加入新鮮蒸餾水5ml，混勻即成。

2.   按表操作

混勻，置37℃水浴10min(或25℃30min)，用540nm波長比色，以空白管調零，讀取各管吸光度。

3.   標準曲線繪制
     1—5為標準曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線。

4.   實驗結果
     根據測定管吸光度，從標準曲線查找相對應的總蛋白濃度。 

注意事項

1．雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2 形成穩定的絡合銅離子，以防止CuSO4·5H20不穩定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比不低于3：1，加入KI作為抗氧化試劑。

2．雙縮脲試劑要封閉貯存．防止吸收空氣中的二氧化碳。

3．本法各種蛋白質的顯色程度基本相同，重復性好，幾乎不受溫度影響，*缺點是靈敏度較低。

4．黃疸血清．嚴重溶血對本法有明顯干擾。

5．本法繪制的標準曲線是一條通過原點的直線，在100g/L濃度之內呈良好的線性關系。