鄒鵬團隊報道基于熒光成像的蛋白質定向進化方法

　　近日，北京大學化學與分子工程學院、合成與功能生物分子中心、IDG麥戈文腦科學研究所、北大-清華生命科學聯合中心鄒鵬課題組（博士生林暢為第一作者）在 Cell 子刊 Cell Reports Methods 上發表了題為：Functional imaging-guided cell selection for evolving genetically encoded fluorescent indicators 的研究論文。

　　該研究報道了基于熒光成像的定向進化方法——Faculae，可在哺乳動物細胞中高效穩定構建突變體文庫，在顯微鏡下針對混合細胞文庫中的優勢表型細胞進行快速光激活選擇。該方法實現了遺傳編碼遠紅色鈣探針的多維度表型篩選與定向進化。

　　熒光探針定向進化的難點在于需要考慮多種熒光表型參數，包括熒光強度和動態響應幅度等，無法直接通過流式分選方法進行篩選，而常用的多孔板陣列文庫成像篩選存在通量較低（~103）局限性，因此研究者認為可以開發一種基于熒光成像的混合細胞文庫鑒定、選擇方法，在保留多篩選維度的同時提高篩選通量、擴大蛋白質序列的搜索空間。

Faculae方法流程示意圖

　　在Faculae方法中，研究者使用基于重組酶的細胞“停機坪”（cell landing pad）方法實現高效穩定的哺乳動物細胞文庫構建，通過聚焦照明實現單細胞分辨的胞內光敏熒光分子激活，“點亮”具有優勢表型的目標細胞，進而通過流式分選回收得到突變體基因型。該技術的特點在于可以利用熒光成像評估細胞內熒光信號的動態變化信息和亞細胞定位信息，單次實驗的細胞鑒定數量為104到105，而單個目標細胞激活僅需1-2秒。利用Faculae方法，研究者對遠紅色鈣探針的亮度與動態響應兩個指標同時開展評估，從中選擇優勢突變體，并通過迭代進化成功獲得靈敏度提升的Nier1探針。

通過Faculae篩選得到的遠紅色鈣探針Nier1s和Nier1b在神經細胞中分別具有更高響應和更高亮度

　　由于Faculae方法能夠在哺乳動物細胞中高效構建突變體文庫，并在顯微鏡下鑒定細胞表型并快速選擇細胞，該方法為進化熒光探針、化學遺傳學元件和光遺傳學元件等蛋白質工具提供了新思路。與此同時，該方法也提供了一種在顯微鏡下簡單、快速選擇多個目標細胞的新策略，已成功應用于純化多能干細胞向心肌細胞分化過程中的中間態細胞。