DNA重組（DNArecombination）技術：工具酶
一、限制性內切酶限制性內切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一類核酸水解酶，能識別和切割雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列。（一）命名原則限制性內切酶大多從細菌中發現，根據來源進行命名，限制酶的第一個字母（大寫，斜體）為宿主菌的屬名，第二、第三個字母（小寫，斜體）代表宿主菌的種名縮寫，第四個字母（斜體）是株或型，最后的羅馬數字表示同株內發現和分離的先后順序。如從流感嗜血桿菌中分離到的幾種限制性內切酶分別命名為HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等等。（二）分類根據酶的結構、作用的不同，可將限制性內切酶分為三種類型。Ⅱ型限制性內切酶具有高度特異性的DNA裂解點,而Ⅰ型和Ⅲ型兼有修飾（甲基化）作用和依賴于ATP的活性，但不能在識別序列上直接裂解DNA，故用途較少。因此，Ⅱ型限制性內切酶是基因工程和基因診斷中重要的工具酶，通常不特別說明的即為Ⅱ型限制性內切酶。（三）限制性內切酶的功......閱讀全文
DNA重組（DNA－recombination）技術：工具酶
一、限制性內切酶限制性內切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一類核酸水解酶，能識別和切割雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列。（一）命名原則限制性內切酶大多從細菌中發現，根據來源進行命名，限制酶的第一個字母（大寫，斜體）為宿主菌的屬名，第二、第三
DNA重組技術－酶切
實驗概要? ? ? ? 通過酶切獲得可進行體外重組的載體和外源DNA實驗原理? ?DNA重組技術是用內切酶分別將載體和外源DNA切開，經分離純化后，用鏈接酶將其連接，構成新的DNA分子。? ? ?限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DN
DNA重組技術：酶切、連接
實驗原理: DNA重組技術是用內切酶分別將載體和外源DNA切開，經分離純化后，用鏈接酶將其連接，構成新的DNA分子。限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。 5’…G↓A
聚合酶鏈反應構建重組DNA
2016年09月12日 15:27 ? 來源:上海江林生物科技有限公司>>進入該公司展臺?實驗材料DNA試劑、試劑盒TE無水乙醇DNA聚合酶CTP儀器、耗材電泳儀離心機PCR儀實驗步驟1. ?制備模板DNA，如DNA不是經氯化銫梯度純化的，100℃煮沸10 min 以滅活核酸酶。?2. ?制備寡核苷
聚合酶鏈反應構建重組DNA
實驗材料 DNA試劑、試劑盒 TE無水乙醇DNA聚合酶CTP儀器、耗材 電泳儀離心機PCR儀實驗步驟 1. ?制備模板DNA，如DNA不是經氯化銫梯度純化的，100℃煮沸10 min 以滅活核酸酶。?2. ?制備寡核苷酸引物，若PCR產物要進行平端克隆，就應該對引物的5’端羥基進行磷酸化處理。?圖一
聚合酶鏈反應構建重組DNA
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 利用聚合酶鏈式反應（PCR），任何兩個DNA片段可連接成一個新的重組DNA分子。通過在PCR引物中引入的額外非同源的核苷酸，可在連接處
DNA重組
目的：簡單介紹了DNA重組技術的一些方法。包括重組質粒、PCR等。包括細胞結構、DNA，DNA如何改點等。
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體3
在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體2
二、噬菌體載體作為細菌寄生物的噬菌體，大多數具有編碼多種蛋白質的基因，能利用宿主細胞的蛋白質合成體系，進行生長和增殖。構建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。㈠ λ噬菌體載體野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個基因。其中約一半基因參與
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定3
當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色，見圖7-11 。如果外源DNA插入片段相當短，不破壞β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的閱讀框，有時產生的重組體菌落不呈白色而是呈淺藍色。4
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定2
（1）CaCl2處理以后的轉化: 當細菌處于0℃、二價陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲溶液中時，細菌細胞膨脹成球形，處于感受態；此時轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，重組DNA在42℃短時間熱沖擊后吸附在細胞表面，在豐富培養基中生長數小時后，球狀細胞恢復原
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體1
載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。常用的載體是通過改造天然的細菌質粒、噬菌體和病毒等構建而成。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型，亦可根據其用途不同分為克隆載體和表達載體二類。載體的構建和選擇應考慮以下
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定1
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
DNA重組技術(DNA－Recombination)
一、DNA 的酶切與連接（1）酶切反應：同質粒DNA 的鑒定，只不過是質粒DNA 換為載體DNA 。若大量酶切，則成比例增加。（2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。（3）15000rpm離心15min，棄上清。（4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄
基因重組和DNA重組區別
基因重組是由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產生DNA片段的交換和重新組合，形成新DNA分子的過程。 在人類的生殖細胞中發現的46條染色體發生在生物體內基因的交換或重新組合。基因重組是生物遺傳變異的一種機制，包括同源重組、位點特異重組、轉座作用和異常重組四大類。DNA重組指DNA分子內或分子間發生的遺傳
DNA重組技術
連接反應的策略?? 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：────────────────────────────────
重組DNA轉化
目的：在體外連接組裝而成的重組DNA分子只能轉入合適的受體細胞，才能大量地進行復制、增殖和表達。通過實驗學會重組DNA轉化的最基本的操作以及如何提高轉化效率的基本思路。?原理：帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構建成后，需要導入適當的宿主細胞內進行繁殖或表達出具有一定生物活性的蛋白。能夠作為重組體
關于DNA重組的重組修復介紹
有絲分裂和減數分裂期間由各種外源因子（例如紫外線，X射線，化學交聯劑）引起的DNA損傷都可以通過同源重組修復機制（HRR）來修復。 人類和嚙齒動物中減數分裂期間HRR所必需的基因產物的缺陷會導致不育 。人類HRR所必需的基因產物（例如BRCA1和BRCA2）的缺陷同時會增加患癌癥的風險。在細菌
什么是工具酶呢？工具酶都有哪些？
作為試劑用于測定化合物濃度或酶活力的酶稱為工具酶。對于底物或產物不能直接測定或難于準確測定的酶促反應，采用酶耦聯法測定。1.NAD（P）十或NAD（P）H偶聯的脫氫酶及其指示反應。2.偶聯H2O2的工具酶及其指示反應有些酶作用于底物時，可使其氧化產生H2O2，在POD的作用下使色素原氧化顯色進行測定
DNA的重組連接
目的：了解T4DNA連接酶的幾種生物學功能及用途；學習在T4DNA連接酶的作用下，載體與目的基因的幾種不同的連接方式以及在標準的連接反應體系中，質粒載體和插入的外源DNA的比率關系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector與PCR產物進行T-A克隆的機理及其應用。原理：外源DNA片段和線狀質粒載
DNA重組技術－連接
實驗概要? ? ? ? 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理? ? 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段， ?然后體外使
DNA重組的定義
DNA復制是指DNA雙鏈在細胞分裂以前的分裂間期S期進行的復制過程，復制的結果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈，每條雙鏈都與原來的雙鏈一樣。這個過程通過邊解旋邊復制和半保留復制機制得以順利完成。
重組DNA的定義
中文名稱重組DNA英文名稱recombinant DNA;rDNA定 義經人工手段對其序列進行了改造和重新組合的DNA。應用學科生物化學與分子生物學（一級學科），方法與技術（二級學科）
重組－DNA－技術簡介
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
重組－DNA－技術介紹
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
DNA重組技術2
?感受態細胞的制備(一)制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞 下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制備的大腸桿菌DHl、DH5和ＭＭ249感受態細胞培養物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108轉化菌落的頻率進行轉化，其他大多數大腸桿菌菌株的最高轉化率大約只有前述菌株的1/10-1/5。
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定3
2．利用末端轉移酶和α-32P-ddNTP標記DNA的3ˊ-末端 在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加入DNA分子的3ˊ-羥基末端，如果作為底物的核苷酸經過修飾（如ddNTP），則可以在DNA的3ˊ-OH上僅加入一個核苷酸。對于雙鏈DNA片段，亦存在DNA的兩側均被標記問題，可通過上述同
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定2
目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定1
㈣ DNA聚合酶 如前所述，選用合適的DNA聚合酶進行測序反應也是保證測序質量的重要因素之一。常用于雙脫氧末端終止法測序的有幾種不同的酶： 1．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 此酶是最早用于建立Sanger測序的酶。但通常會有兩個問題：①Klenow片段的持續合成能力較
DNA重組實驗方法
[實驗原理]DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。常用的DNA連接酶是T4噬