Pichia酵母表達直接PCR鑒定重組子的方法
模板的處理：1.平板上的菌落長到肉眼可見時（約12小時）；2.將除了模板之外的其它PCR反應液的組分準備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可以鑒定非定向克隆的方向）；3.用半根滅菌的牙簽（節約，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一個滅菌的1.5毫升離心管，對PCR管和1.5毫升離心管編號；4.PCR擴增，1％ 瓊脂糖凝膠電泳；5.對于PCR擴增顯現特異性條帶的克隆，把置于1.5毫升離心管中的半截牙簽扔到5毫升YPDZ培養基中，30度培養，8－12小時后提質粒，酶切鑒定確認。 PCR反應體系：以TaKaRa Taq DNA聚合酶反應為例，引物為5′ AOX1 primer，3′AOX primer：組分 20μl體系10xReaction Buffer 2.0μldNTP &nbs......閱讀全文
Pichia酵母表達直接PCR鑒定重組子的方法
模板的處理：1.平板上的菌落長到肉眼可見時（約12小時）；2.將除了模板之外的其它PCR反應液的組分準備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可以鑒定非定向克隆的方向）；3.用半根滅菌的牙簽（節約，而且好用）挑取菌落，在PCR
Pichia酵母表達系統操作方法
我先說我有的質粒和菌株：PPIC9K，PPIC9，PPICZahphaA，B，C以及一個改造的PPIC9K載體，EcoRI和BamHI雙酶切，C末端引入了一個6histag菌株：GS115，KM71，X33，以及十幾個空載體對照菌株我的酵母表達Protocol：>10ug質粒用Sal線性化，加1/1
重組畢赤酵母的表達
實驗概要本文介紹了重組畢赤酵母目的基因表達的方法及條件，為畢赤酵母表達因素給予指導，但對于任何表達系統，最優化條件因表達蛋白的特征而不同。實驗步驟1. Mut 胞內或分泌表達：為檢測表達條件是否有效，可培養GS115β-gal (Mut )(胞內表達-半乳糖苷酶)。親代載體轉化GS115 或KM71
畢赤酵母表達（pichia－pastoris－expression－）實驗手冊（3）
液體YPD培養基可常溫保存；瓊脂YPD平板在4℃可保存幾個月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養基，可以4℃條件下保存1～2周。2.4 YPDS + Zeocin 培養基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract
畢赤酵母表達（pichia－pastoris－expression－）實驗手冊（2）
一．畢赤酵母表達常用溶液及緩沖液的配制1．1 各種母液的配制10*YNB （含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎氮源培養基） 4℃保存。34g酵母基礎氮源培養基（無硫酸銨）+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存期為1年。2
畢赤酵母表達（pichia－pastoris－expression－）實驗手冊（4）
三．主要試驗環節的操作3.1 酵母菌株的分離純化接種GS115于5ml YPD液體培養基，30℃，200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30℃培養48 小時，用 YNB基本培養基和含His的補充培養基作點種分離純化，挑選在補充培養基生上生長而在基本培養基上不生長的單菌落劃YPD平板，4℃保存。3.
畢赤酵母表達（pichia－pastoris－expression－）實驗手冊（6）
隨著PCR技術的不斷發展成熟（擴增長度、保證性、產量和特異性等），質粒構建過程的大多數細胞內的DNA復制將被PCR這一細胞外的DNA復制所代替，質粒構建效率將有質的飛躍。4.4密碼子的偏好性的原則酵母菌對外源基因的表達也和外源基因密碼子的選用有關。了解表達系統宿主在密碼子使用上的偏愛性對從翻譯水平分
畢赤酵母表達（pichia－pastoris－expression－）實驗手冊（5）
3.5 Pichia酵母表達直接PCR鑒定重組子的方法3.5.1 模板的處理：1. 平板上的菌落長到肉眼可見時（約12小時）；2. 將除了模板之外的其它PCR反應液的組分準備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可以鑒定非
畢赤酵母表達（pichia－pastoris－expression－）實驗手冊（1）
大腸桿菌表達系統最突出的優點是工藝簡單、產量高、周期短、生產成本低。然而，許多蛋白質在翻譯后，需經過翻譯后的修飾加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等過程才能轉化成活性形式。大腸桿菌缺少上述加工機制，不適合用于表達結構復雜的蛋白質。另外，蛋白質的活性還依賴于形成正確的二硫鍵并折疊成高級結構，在
原位雙膜法快速檢測Pichia酵母系統陽性表達株
1） 將醋酸纖維素薄膜置于MD/His -平板的His + 轉化子菌落上,用涂布棒輕壓使醋酸纖維素薄膜完全濕潤并趕盡氣泡, 使所有菌落轉移到醋酸纖維素薄膜上.2) 在BMMY板上置一同樣大小的硝酸纖維素薄膜, 并將醋酸纖維素薄膜菌落向上置于硝酸纖維素薄膜上. 30 ℃孵育18 h 后, 將醋酸纖維素
菌落PCR，快速鑒定重組質粒
質粒快速鑒定????試劑：?Protoplasting buffer:?30mM Tris-HCl, pH8.0????????????????????0.33ml/1.0M????????5mM?EDTA????????????????????????????????0.1ml/0.5M?????
大連化物所周雍進團隊實現甲醇酵母的高效代謝改造
近日，中國科學院大連化學物理研究所合成生物學與生物催化創新特區研究組研究員周雍進團隊在甲醇酵母合成生物學研究中取得進展，實現了甲醇酵母的高效代謝改造。科研人員在甲醇酵母代表菌株畢赤酵母中，構建了基因編輯工具，強化了同源重組從而實現了精確基因編輯，鑒定了染色體基因整合位點并表征了系列不同表達強度的
畢赤酵母如何做表達
Pichia.pastoris酵母菌體內無天然質粒，所以表達載體需與宿主染色體發生同源重組，將外源基因表達框架整合于染色體中以實現外源基因的表達。包括啟動子、外源基因克隆位點、終止序列、篩選標記等。表達載體都是穿梭質粒，先在大腸桿菌復制擴增，然后被導入宿主酵母細胞。為使產物分泌胞外，表達載體還需帶有
真核細胞表達系統1
自上世紀70年代基因工程技術誕生以來，基因表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。并隨著人類基因組計劃實施的進行，在技術方法上得到了很大發展，時至今日已取得令人矚目的成就 。隨著人類基因組計劃的完成，越來越多的基因被發現，其中多數基因功能不明。利用表達系統在哺乳動物細胞內表達目的基因是研究基
基因克隆的基本步驟有哪些
基因克隆的基本步驟流程如下：一、目的DNA片段的獲得：DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群DNA分子，這些DNA分子或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉錄合成的雙鏈 cDNA分子。由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機
酵母菌落PCR方法
問：很郁悶，zui近在做電轉畢赤酵母，但是轉化完了沒有合適的篩選方法，如果提基因組的話費時費錢，而且由于我這個電轉的幾率十分低，也就有1%-10%，所以想用菌落PCR方法篩選，但酵母菌破壁很困難，如果處理不好的話基因組釋放不出來，就沒有陽性結果了。查了一些資料說用反復凍融法，是不是直接挑單菌落就行了
選擇重組蛋白表達的合適方法
重組蛋白是研究生物學過程的重要工具。需要使用表達系統來對其進行制備。合適表達系統的選擇取決于重組蛋白的特性、重組蛋白的預期應用以及該系統能否生產足夠量的蛋白質。作者： 伯吉斯等,主譯：陳薇，本實驗來自「蛋白質純化指南」實驗步驟一、引言選 擇 合 適 醜 組 蛋 白 表 達 方 法 對 于 能 否 及
選擇重組蛋白表達的合適方法
實驗步驟 一、引言 選 擇 合 適 醜 組 蛋 白 表 達 方 法 對 于 能 否 及 時 獲 取 所 需 數 量 和 質 量 的 重z組蛋白非常關鍵。選 擇 了 錯 誤 的表達宿主可 能 導 致 蛋 白 質錯 誤 折 疊 或
DNA的克隆過程概述
DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此DNA克隆又稱分子克隆，基因操作或重組DNA技術。DNA克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的
關于重組子的篩選方法介紹
1、抗生素篩選法：菌株為某種抗生缺陷型，而質粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉化子才能在含該抗生素的培養基上長出。本實驗利用抗生篩選轉化子。 2、互補法：至今使用的許多載體（如PUC系列）有含有一個大腸桿菌DNA的短區段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的調控序列和
畢赤酵母表達系統能在釀酒酵母里表達么
不太可能，Invitrogen的商業化畢赤酵母表達系統屬于甲醇酵母表達系統，用的是畢赤酵母獨有的AOX1啟動子，由甲醇誘導；釀酒酵母用的啟動子大多用的是GAPDH或Gal啟動子等，由葡萄糖和半乳糖誘導。雖然兩種菌株有很多基因具有較高的同源性，但不能通用。建議使用畢赤酵母表達系統，釀酒酵母表達量低，誘
酵母表達載體的構建與酵母轉化
實驗概要本實驗介紹了酵母表達載體的構建、酵母轉化方法及酵母抗逆實驗。主要試劑試劑配制：1 .1 M Tris.Cl(pH 7.5)(100 ml)：12.1g Tris堿，加80 ml ddH2O，濃HCl調pH 7.5，定容至100 ml；2. 0.5 M EDTA(pH 8.0) (100 ml
簡述甲醇營養型酵母表達系統
甲醇酵母表達系統是應用最廣泛的酵母表達系統。甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應用最多。 甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色
酵母遺傳學方法12：酵母菌落PCR方法
酵母菌落PCR方法1．在冰上配制反應混合液：2μl??????????????????10×菌落PCR緩沖液1.2μl?????????????????25mmol/L MgCl20.4μl?????????????????10mmol/L dNTPs10pmol????????????????引物
質粒的酵母直接轉化
1．用牙簽從平板中挑取單菌落（直徑2～3mm），轉移到1.5ml的無菌離心管中。2．將10μl載體DNA（100μg）與10μl轉化質粒DNA混合，振蕩均勻。（若轉化DNA是用未經RNA酶處理的“mini－prep DNA”方法制得，則不需加載體DNA）。3．加0.5ml PLATE溶液，振蕩。PL
質粒的酵母直接轉化
實驗方法原理將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結合域融合構建誘餌質粒；將誘餌質粒轉化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉化的酵母；再將文庫質粒轉化到酵母中實驗材料單菌落試劑、試劑盒PLATE溶液載體DNA轉化質粒DNA儀器、耗材離心管離心機實驗步驟1、 用牙簽從平板中挑取單菌
酵母菌直接鏡檢計數方法
酵母菌直接鏡檢計數法：適用于由酵母菌引起變質的食品。方法是利用血細胞計數板，取一滴美藍染色液，從計數板蓋片一側滴入計數池，計數5個中格中的酵母細胞數，著色的細胞為死細胞，不著色的細胞為活酵母細胞，可分別計數，按下面公式計算：酵母數（個/ml）=5個中格（80個小格）內酵母數*稀釋倍數*10（6）/2
直接原位PCR（In－situ－PCR）操作方法
原位PCR是原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結合的技術，使得靶基因檢測有了極大的改進。此技術是在細胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對靶基因片段進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。1．組織切片和細胞樣品的制備【試劑與配置】10%福爾馬林二甲苯PBS【
基因工程角蛋白酶的研究
以往對角蛋白酶的研究工作主要集中于菌種篩選、酶的提取純化和活力測定等基礎工作，對酶結構和基因表達的研究極少。20世紀90年代，隨著分子生物學技術的發展，國外的一些學者開始進行角蛋白酶基因工程表達和分子結構等方面的研究。Lin X等采用隨機引物PCR的方法獲得了編碼地衣芽孢桿菌PWD-1菌株分泌的角蛋
重組子的篩選的原理和方法
根據載體 的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點(MCS)，它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而