OsAGAP蛋白的ArfGTPase激活活性測定

實驗概要

本實驗誘導表達了Arf-GST和OsAGAP-GST融合蛋白，純化后測定了OsAGAP蛋白的Arf GTPase激活活性。

主要試劑

1. GST融合蛋白純化試劑盒(Pharmacia公司)

2. Enzcheck TM Phosphate檢測試劑盒(Molecular ProbesCo.)

實驗步驟

1. Arf-GST和OsAGAP-GST融合蛋白的誘導表達

參照Pharmacia公司的GST融合蛋白純化試劑盒說明書進行。

   1) 將重組載體pGEX-4T-1-Arf，GEX-4T-1-OsAGAP以及作為對照的空載體pGEX-4T-1轉入大腸桿菌BL21中；

   2) 挑取單克隆接種于LB培養基中，37℃培養過夜；

   3) 取過夜培養物按I/50的比例擴大培養至OD₆₀₀為0.8-1.0，加入IPTG至終濃度為1mM，37℃繼續培養4h；

   4) 吸取lml培養物，離心收集菌體；

   5) 向菌體沉淀中加入100ulSDS樣品緩沖液，混勻，煮沸3-5min，離心取上清進行SDS-PAGE凝膠電泳，檢測融合蛋白表達情況。

2. 酶溶法裂解細菌細胞

   1) 將IPTG誘導后的培養物，4℃，5000rpm，離心5min，收集菌體；

   2) 棄上清，按照每克細菌沉淀加入3ml裂解緩沖液的比例將沉淀懸浮(冰上進行)；

   3) 向懸浮液中加入蛋白酶抑制劑PMSF(50mM)及溶菌酶，攪拌20min，在攪拌過程中加入脫氧膽酸鈉(冰上進行)；

   4) 溶液變得粘稠時，加入DnaseI，室溫放置至溶液不再粘稠(冰上進行)；

   5) 4℃，12000g，離心15min，上清即為蛋白粗提液。

3. 用Glutathione Sepharose 4B進行融合蛋白的大量純化

   1) 將Glutathione Sepharose 4B柱體事先用1 X PBS平衡，之后加入細菌裂解液上清:

   2) 室溫下多次混勻，充分結合；

   3) 待Glutathione Sepharose 4B顆粒自然沉降之后，緩慢放出液體:

   4) 用10倍柱體積的1 X PBS清洗柱體，重復兩次；

   5) 按每lml柱體積對應于1 ml洗脫液的比例加入洗脫液，室溫孵育10min使洗脫液中的還原性谷膚甘膚置換柱體中結合的融合蛋白；

   6) 收集洗脫液；

   7) SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的純化及洗脫效果。

4. OsAGAP蛋白的Arf GTPase激活活性測定

GTPase測定實驗使用Enzcheck TM Phosphate檢測試劑盒(Molecular ProbesCo.)完成，操作參照試劑盒說明書。

將反應混合物(1uM Arf-GST融合蛋白，0.2 mM GTP，0.2 ml MESG，10ul purine nucleotide phosphorylase，HEPES buffer)加入1.5 ml Ep管中，22℃溫育20min，以除去體系中游離磷的污染。反應混合物加入比色皿中，加入250 nMOsAGAP-GST融合蛋白，360nm立刻讀數，然后每5min讀數一次，至30min，根據讀數繪制標準曲線。以不加OsAGAP-GST融合蛋白反應體系作為活性測定實驗的本底對照。