Science等兩篇論文實現CRISPR多基因編輯與多重基因編輯

　　12月，首先是Braod研究院的研究人員在CRISPR–Cpf1的基礎上打造了一個多重化基因編輯系統，其后，來自中科院動物所的研究人員也在CART細胞中實現多基因編輯。這兩項成果分別公布在Science和Cell Research雜志上。

　　CRISPRs和CRISPR相關蛋白（Cas）蛋白的新應用，已經徹底改變了基因工程。在單引導性RNA（sgRNA）的指導下，CRISPR-Cas9系統可在任何基因組位點上產生雙鏈斷裂（DSBs）。這些DSBs可以由HR或通過非同源末端連接（NHEJ）修復。

　　第一代CRISPR技術：CRISPR-Cas9能夠在引導RNA的指引下，靶標并切割入侵者的遺傳物質。第二代CRISPR-Cpf1也能在crRNA的引導下在人類細胞中剪切目標DNA。

　　Braod研究院的研究人員在此基礎上打造了一個多重化基因編輯系統。過去用Cas9靶標多個基因組位點需要構建多個或者很大的表達載體，使這種基因組編輯技術受到一定的局限。研究人員發現，Cpf1能夠加工自己的CRISPR RNA (crRNA)。而且Cpf1介導的pre-crRNA加工是獨立于DNA剪切的。這種能力可以用來簡化多重基因組編輯。他們在此基礎上設計CRISPR陣列，用一個載體同時在哺乳動物細胞編輯了四個基因，在小鼠大腦編輯了三個基因。

　　此外，中國科學院動物研究所王皓毅研究組利用CRISPR-Cas9技術將αβT-cell receptor (TCR)從異體的CART細胞中敲除，避免移植物抗宿主病（graft-versus-host-disease，GVHD）的發生，將人類白細胞抗原（HLA）敲除降低自身的免疫原性。

　　另外，PD-1是同腫瘤免疫逃逸相關的T細胞表面抑制因子，考慮到阻斷PD-1信號通路在許多腫瘤類型中都取得了較好的療效，研究人員同時在CART細胞中敲除了PD-1基因，來阻斷PD-1信號通路。

　　制備異體CART細胞需要進行多基因同時編輯，CRISPR-Cas9這一RNA介導的DNA核酸酶系統是非常適合的技術平臺。在此項研究中，利用CRISPR-Cas9系統對CART細胞進行雙基因（TRAC和B2M）或者三基因（TRAC，B2M及PD-1）敲除。結果表明，這些經過基因編輯的CART細胞同普通CART細胞相比，在體外及體內具有相當或更強的腫瘤細胞殺傷功能，有望成為臨床應用的效應細胞。

　　CART（Chimeric Antigen Receptor T cell）細胞治療是非常有前景的腫瘤治療方法，嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor，CAR）是由人工設計合成的跨膜蛋白，包括細胞外、跨細胞膜以及細胞內三個部分。CAR的細胞外部分主要是識別特定抗原的單克隆抗體可變區（scFV），負責識別特異性抗原。跨膜區確保CAR可以在細胞膜上定位，而細胞內區域則負責激活T細胞，產生T細胞介導的免疫反應。臨床數據表明，CART在B細胞惡性腫瘤治療中取得了很好的療效。

　　但是，目前采用的方法都是自體過繼細胞治療（autologous adoptive cell transfer，ACT），這種方法昂貴并且耗時。對于新生兒及老年患者，很難獲得足量且狀態良好的淋巴細胞用于CART細胞治療。因此目前CART細胞治療的一個重要研究方向是怎樣使用一個健康獻血者的T細胞制備大量的CART細胞，滿足數百名患者的臨床使用。這一技術的建立將極大降低CART療法的成本，可以更好地保證統一制備的細胞質量，而且患者在需要時可以馬上得到CART細胞進行治療。