Southernblot實驗

實驗方法原理 互補的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的，可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細胞總DNA 或總RNA。根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細胞內雜交, 即細胞原位雜交。分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性或非放射性標記的探針與被固定的模板雜交，經顯影或現色后檢測出目的DNA 或RNA 分子所處的位置。

實驗材料 基因組DNAPCR產物

試劑、試劑盒 EcoR l 反應bufferTBEDNA landing buffer變性液SSC轉移液Washing bufferdetection buffermaleic acid buffer

儀器、耗材 eppendorf 管Tip頭PCR儀無粉手套水平電泳儀轉移槽尼龍膜吸水紙及濾紙

實驗步驟

1.   基因組DNA限制性內切酶酶切
    
   （1）設置50 ul 反應體系，在200 ul EP管中加入：
    
   10 ug 基因組DNA x ul

去離子水 49-x ul

10×buffer 5 ul

EcoR Ⅰ 4 ul
 
（2）充分混勻，離心20 s。
 
（3）置于PCR議上37℃反應過夜。
 
（4）加1/10體積乙酸鈉、2體積無水乙醇沉淀DNA晾干。
 
（5）加20 ul TE buffer溶解DNA。
 
2.  DNA瓊脂糖凝膠電泳
 
（1）用0.5×TBE buffer配制0.8%瓊脂糖凝膠，微波爐加熱至溶化，加入EB（0.5 ug/ml）混勻后倒入制膠器中室溫凝固。
 
（2）凝固后，去除樣品梳及膠帶，置于水平電泳儀中。
 
（3）將DNA樣品用6×DNA landing buffer 混勻后加入樣品孔中，恒壓電泳（20 V/10 mA）直至染料電泳至邊緣。
 
（4）電泳完畢，取出凝膠切角并在凝膠成像系統成像記錄。
 
3.  DNA轉移與固定
 
（1）凝膠置于0.25 M HCl中處理30 min，去離子水洗1次。
 
（2）堿變性：凝膠置于0.4 M NaOH變性液中作用20 min。
 
（3）毛細管法轉移：根據凝膠大小裁剪與其等大小尼龍膜、濾紙片，尼龍膜一角軟鉛筆作方位標記。
 
（4）去離子水浸泡尼龍膜、濾紙片，中再浸泡5 min。
 
（5）按下圖安裝轉移槽進行轉移過夜（0.4 M NaOH轉移液）。
 
（6）轉移完畢后取出尼龍膜，2×SSC浸泡5 min，濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙。

 
4.  預雜交與雜交
 
（1）預雜交：將尼龍膜置于預熱DIG Easy Hyb工作液（37℃~42℃）中搖晃充分作用30 min。
 
（2）探針變性：DIG標記探針煮沸5 min 后迅速置于碎冰中，用預熱DIG Easy Hyb工作液制備含探針的雜交液。
 
（3）棄去預雜交液，加入雜交液42℃搖動孵育4小時或過夜。
 
（4）2×SSC（in 0.%SDS）洗膜2次（5 min×2），不斷搖動。
 
（5）5×SSC（in 0.%SDS）洗膜2次（155 min×2，65~68℃），期間不斷搖動。
 
5.  雜交檢測
 
（1）Washing buffer潤洗1遍（3~5 min）。
 
（2）100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。
 
（3）100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
 
（4）Washing buffer洗膜（15 min×2）。
 
（5）20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
 
（6）將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數min至1天（出現顏色時不要搖動）。
 
（7）當出現條帶時，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現色。
 
（8）照相記錄，80℃烤干，儲存。
 
（9）掃描計算EGFR基因擴增的倍數。

注意事項

1. 為了防止緩沖液流從凝膠邊緣之外通過，沿凝膠的每一邊放置一條 Parafilm膜，使濾紙橋與層疊上部的吸濕材料無法接觸。

2. 核酸轉移的選擇尼龍膜比NC膜好，是目前較理想的核酸固相支持膜。

3. 尼龍膜漂洗盡量徹底，可降低背景。

4. color-substrate solution要新鮮配制。

5. Tm = 49.82 + 0.41 （% G + C） - （600/l） [l = length of hybrid in base pairs], Topt. = Tm –20 to 25° C（The given numbers of the equation were calculated according to a standard（The given numbers of the equation were calculated according to a standard equation for hybridization solutions containing formamide, 50%.） The actual hybridization temperature Topt. for hybridization with DIG Easy Hyb is 20-25° C below the calculated Tm value. Topt. can be regarded as a stringent hybridization temperature allows up to 18% mismatches between probe and target. When the degree of homology of your probe to template is less than 80%, you should lower Topt. accordingly （approx. 1.4°C below Tm per 1 % mismatch） and alsoadjust the stringent washing steps accordingly （i.e. increase SSC concentration and lower washing temperature）.