聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆（二）
二、PCR反應參數1、變性：在第一輪循環前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性，減少DNA產量.一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。對于富含GC的序列，可適當提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。2、退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃。一般當引物中GC含量高，長度長并與模板完全配對時， 應提高退火溫度。退火溫度越高， 所得產物的特異性越高。有些反應甚至......閱讀全文
聚合酶鏈式反應
實驗方法原理 實驗材料 熱穩定 DNA 聚合酶旁觀者 DNA正向引物反向引物模板 DNA試劑、試劑盒 擴增緩沖液氯仿dNTP 貯存液儀器、耗材 聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠屏蔽型槍頭離心管正向排液式移液器PCR儀實驗步驟 一、材料1. 緩沖液與溶液10X 擴增緩沖液氯仿4 種 dNTP 貯存液（20
聚合酶鏈式反應
一、材料1. 緩沖液與溶液10X 擴增緩沖液氯仿4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)2. 酶與緩沖液熱穩定 DNA 聚合酶3. 凝膠聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠4. 核苷酸與寡聚核苷酸旁觀者 DNA正向引物（20 μmol/L）及
聚合酶鏈式反應
實驗方法原理實驗材料熱穩定 DNA 聚合酶旁觀者 DNA正向引物反向引物模板 DNA試劑、試劑盒擴增緩沖液氯仿dNTP 貯存液儀器、耗材聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠屏蔽型槍頭離心管正向排液式移液器PCR儀實驗步驟一、材料1. 緩沖液與溶液10X 擴增緩沖液氯仿4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/
聚合酶鏈式反應（PCR）
PCR技術可用于：（1）檢驗感染性疾病是否處于隱性或亞臨床狀態；（2）有效檢測癌基因的突變，準確檢測癌基因的表達量；（3）臨床應用于檢測地中海貧血的基因突變。實驗方法原理基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成
PCR）聚合酶鏈式反應
?PCR技術可用于：（1）檢驗感染性疾病是否處于隱性或亞臨床狀態;（2）有效檢測癌基因的突變，準確檢測癌基因的表達量;（3）臨床應用于檢測地中海貧血的基因突變。 實驗方法原理 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 PCR由變性--退火--
聚合酶鏈式反應（PCR）
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術之一。典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環，通過多次循環反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是
聚合酶鏈式反應（PCR）
實驗概要聚合酶鏈式反應（Polymerase ?Chain ?Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術之一。典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環，通過多次循環反應，使目的DNA得以迅速擴增。
聚合酶鏈式反應（PCR）
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術之一。典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環，通過多次循環反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是
原位聚合酶鏈式反應和原位反轉錄聚合酶鏈式反應操作
（一）、儀器設備 ????英國Thermo Hybaid原位PCR儀。 ????（二）、操作流程? ?????1、原位PCR步驟 ?????1）預處理： ?????（1）切片常規脫蠟； ?????（2）0.2mol/L HCl處理10min； ?????（3）5μg/ml蛋白酶K消化組織37℃1
原位聚合酶鏈式反應原位反轉錄聚合酶鏈式反應操作規程
（一）、 儀器 設備 英國Thermo Hybaid原位PCR儀。 （二）、操作流程 1、原位PCR步驟 1）預處理： （1）切片常規脫蠟； （2）0.2mol/L HCl處理10min； （3）5μg/ml蛋白酶K消化組織37℃10min； （4）Nase消化組織37℃ 30m
原位聚合酶鏈式反應原位反轉錄聚合酶鏈式反應操作規程
（一）、儀器設備 ????英國?Thermo Hybaid?原位?PCR?儀。 ????（二）、操作流程? ?????1?、原位?PCR?步驟? ?????1?）預處理： ??????（?1?）切片常規脫蠟； ??????（?2?）?0.2mol/L HCl?處理?10min?； ??????（
什么是聚合酶鏈式反應
聚合酶鏈反應（PCR）是在試管中，能在較短的時間內使極微量的特定核酸擴增百萬倍（106～109），故又稱基因擴增技術，其敏感性遠遠超過包括放射免疫在內的所有血清學檢驗方法。其是目前世界上研究感染性疾病、遺傳性疾病的早期診斷和癌細胞基因檢測、基因突變的先進技術。只要患者體內極微量的乙肝病毒和丙肝、庚肝
聚合酶鏈式反應（PCR）實驗
? ? ? ? ? ? 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒 MgCl2 DNA聚合酶 Buffer dNTP
聚合酶鏈式反應的原理
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DN
聚合酶鏈式反應（PCR）實驗
實驗材料 DNA試劑、試劑盒 MgCl2DNA聚合酶BufferdNTP儀器、耗材 毛細管薄壁離心管PCR擴增儀瓊脂糖電泳實驗步驟 1、 反應體系： （反應溶液可置于毛細管或薄壁離心管中擴增）2、操作過程：（所用儀器為AMP1605熱循環PCR擴增儀預變性：94 ℃ 90秒循環過程：94 ℃ 1秒
聚合酶鏈式反應（PCR）（二）
七、PCR檢測?PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。收起
聚合酶鏈式反應（PCR）（一）
實驗方法原理 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。?PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結
聚合酶鏈式反應（PCR）實驗
PCR是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。其特異性是由兩個人工合成的引物序列決定的。所謂引物就是與待擴增DNA片段兩翼互補的寡聚核苷酸，其本質是ssDNA片段。待擴增DNA模版加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA的兩翼序列特異復性。此時，兩引物的3'端相對，5'向背。在合適的
聚合酶鏈式反應(PCR)技術
原理聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction PCR)是一種體外擴增特異性DNA片段的技術。它可以在體外特異地對目的基因進行大量擴增，其巧妙之處在預先設計合成二段分別與待測目的基因二端互補的引物，以起到指向定點的作用；再借助于DNA聚合酶催化的若干次擴增反應后，即可使特
聚合酶鏈式反應模板的制備
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。 標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難
聚合酶鏈式反應的發展背景
Khorana (1971)等最早提出核酸體外擴增的設想：“經DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可合成tRNA基因。”但由于當時基因序列分析方法尚未成熟，熱穩定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實際意義。加上分子克隆技術的出現提供了一種克隆
聚合酶鏈式反應的原理簡介
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，
聚合酶鏈式反應(PCR)技術概述
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術是基因擴增技術的一次重大革新，是分子生物學發展史中的一個重要里程碑。使用PCR擴增技術，可以將極微量的靶DNA片段特異地擴增上百萬倍，大大提高了對DNA分子的分析和檢測能力。PCR技術具有敏感度高、特異性強、快速簡便等優
聚合酶鏈式反應檢查的簡介
聚合酶鏈式反應是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。PCR技術類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
什么是PCR聚合酶鏈式反應－？
?PCR即聚合酶鏈式反應 (Polymerase Chain Reaction，以下簡稱PCR)，是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，可理解為生物體外特殊的DNA復制。
聚合酶鏈式反應及其產物分析
?實驗原理：PCR擴增是模擬天然DNA復制過程，利用DNA聚合酶在體外（試管中）擴增一對引物之間特異性DNA片段的方法。其主要熱循環過程可分為三個步驟： （1）高溫變性（denature）：提供DNA復制的有效模板。 （2）低溫退火（anneal）：引物與模板DNA復性，提供游離3’-OH端
RNA聚合酶鏈式反應(PCR)步驟
1），準備工作? ? 8， 實驗器具與材料: (1)移液槍:200ul、10ul (2)吸頭:200ul、20ul? ? (3)吸頭臺:放置 200ul 和 20ul 的吸頭一個 (4)EP 管 1.5ml、100ul2），實驗器具的處理與準備? ? (1) 塑料制品:(包括吸頭、EP 管等)? ?
聚合酶鏈式反應（PCR）的原理
PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備
聚合酶鏈式反應（PCR）反應特點
特異性強PCR反應的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結合；②堿基配對原則；③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模
DNA聚合酶鏈式反應的概述
這項技術有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題，被廣泛地應用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、基因克隆和DNA序列測定等各方面。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年發現 ，而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E. Coli