realtimePCR體系的優化
實時定量PCR以其精確、快速、方便，越來越多的應用在科研、臨床及檢驗檢疫的各個領域。但是定量PCR是對精確性要求很高的實驗，實驗的條件對實驗結果的影響非常大。在此談談體系優化的問題，希望對做相關試驗研究的朋友有所幫助。1、基本參數的優化：1）MgCl2的濃度：在PCR反應中，MgCl2的濃度對酶的活性是至關重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應中得到較低的 Cp(crossingpoint)值（指PCR達到指數擴增期時，產生一定的熒光高于背景并為儀器所識別時的循環數），較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的濃度選擇應慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應，應選擇2－5mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的 RT－PCR而言，則應選擇的濃度為4－8mM。2）模板的濃度：如果研究者是進行首次實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至......閱讀全文
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
Realtime－PCR－數據導出－——－ABI儀器篇（一）
1. Real-time PCR數據：Real-time PCR完成后，所有數據并非可以直接導出，由于每一次實驗的情況都不相同，儀器的很多默認設定都會對最終數據結果造成重大偏差，所以在完成PCR過程后，需要人為對實驗結果進行條件設置，才能提取到科學有效的實驗結果，進而完成對實驗結果的分析和判斷。
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR負對照有信號問題分析
引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。 模板有基因組的污染：RNA?提取過程中避免基因組?DNA?的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
引物設計原則（Principle－of－realtime－quantiation－PCR－primer－）
1、引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74°C，不適于Taq?DNA聚合酶進行反應。2、引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤
Realtime－PCR實驗心得和RNA提取心得
并不是所有的實驗都可以做real－time的，技術路線要選好當你的基因表達量少或有些不表達具體就是做普通pcr跑膠條帶比較弱，不是很亮的情況下個人覺得最好不要選擇real，不容易做好，特別是融解曲線用sbgr green染料做的話，引物設計時擴增片斷最好小于250bp，太長了不好擴預實驗先rt－pc
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
Realtime－PCR－數據導出－——－ABI儀器篇（二）
??????6.?StepOne閾值（Threshold）：選中孔板中所有的數值，如下界面選擇log、Target對話框?????將每個基因的Tredshold?Auto勾選掉，閾值數值調整范圍原則在指數增長期。閾值數值調整范圍原則在指數增長期，該范圍中，曲線斜率相同，ΔCT值不變??????注意同
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
Realtime同電泳檢測產物的PCR有何優勢？
?Real-time qPCR通過熒光信號在每個反應循環終點檢測，反應指數增長期，可以真實監測模板起始量，線性范圍可達5——7個數量級；而終點法重復性不佳、線性范圍較窄，且產物電泳檢測受限于片段大小和凝膠分辨率、膠染料靈敏度等因素，線性范圍在100-fold左右。
做－realtime－PCR之前，你應該如何著手設計引物
正在著手做 real-time?PCR?的朋友們，我想最開始肯定要考慮引物設計的問題。看完下面的文字，我保證你得到想要的引物設計方法和引物序列。第一步：拿到你所要研究的基因的序列。不要告訴我你不會找序列。如果真的不會，請參考丁香園內其他版塊，如NCBI使用，序列查找等。第二步：確定你想用哪種方法。T
RealTime－PCR－(qPCR)常見問題及解決方案
Real Time PCR(qPCR)，即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，是一種利用熒光染劑檢測每次PCR循環后產物總量的方法技術，是常規PCR的衍生反應。主要是通過熒光信號的變化實時監測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析。因其具有靈敏、特異、
食物過敏原的檢測和定量方法即時（realtime）PCR法
即時PCR方法與其他DNA定量方法相比，即時PCR方法需要昂貴的實驗室設備，但準確度高，勞動強度低。即時PCR方法不用凝膠制品而使用特定目標的低聚核苷酸探子，因而實現即時分析。
realtime－PCR復孔間的重復性差怎么辦
學習做Realtime PCR, 實驗結果是出來了,得到的內參、目的基因的Ct 值在15-25 之間,熔 融曲線基本上也是單峰,但不太會處理這個結果,對著數據發愁.不同的處理方法得到不 同的結果. 做的是相對定量,SYBR Green, 選用2^（-△ △ Ct）法 內參基因：對照。
無需ROX校準的Azure－Cielo?－RealTime－PCR光學系統的應用
ROX是一種廣泛使用的惰性熒光染料，通常添加到qPCR反應液中以校正熒光信號。然而，隨著熒光技術在儀器中的發展，比如在Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統，為了標準化而單獨使用染料的步驟已不再需要。當實時熒光定量PCR系統首次引入市場時，許多產品使用固定光源和檢測系統對96孔整板進行同
Realtime－PCR實驗注意事項（防RNA酶污染和常用RNA酶抑制...2
[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會有蛋白質污染，影響比值2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。總mRNA的提取(自己的經驗)一、關
Realtime－PCR實驗注意事項（防RNA酶污染和常用RNA酶抑制...1
實驗中的一些好習慣 加入試劑之前,把它混勻一下,以免放置時間長了濃度不均 移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性 一定要記著關水浴箱，切記切記 多和大家討論，同時多關注別人討論的經驗，這幾乎是最快提高的捷徑了 所有的試劑都自己配
Realtime－PCR實驗注意事項（防RNA酶污染和常用RNA酶抑制...3
DEPC處理方法如下：1.DEPC處理（1）DEPC水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。（2）Tip頭(槍頭）、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭；EP管和PCR反應管等）：用0.1%的DEPC水（1000 m
qPCR－Protocol－for－SNP－Genotyping
實驗概要Platinum??qPCR ?SuperMix for SNP Genotyping is a ready-to-use reaction mix for the ?amplification and identification of single-nucleotide polymorp
實時熒光定量PCR的研究進展及其應用（二）
1.3 定量方法 在real-time Q-PCR中，模板定量有兩種策略；相對定量和絕對定量。相對定量指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化。絕對定量指的是用已知的標準曲線來推算未知的樣本的量。 1.3.1 標準曲線的法的相對定量 由于在此方法中量的表達是相對于某個參照物的量而言的
實時熒光定量PCR
Real Time PCR實時熒光定量PCR? 其定量的基本原理是在?PCR 反應體系中加入非特異性的熒光染料（如：?SYBR GREEN I ）或特異性的熒光探針（如：?Taqman 探針），實時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環次數：?CT 值（?Cycle
實時熒光定量pcr儀技術原理
所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 real-time 技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的
實時熒光定量PCR儀的技術原理
所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 real-time 技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的
關于諾瓦克病毒的標本檢測的方法介紹
為避免實驗室污染，食品、水、環境樣品與病人標本不能在同一實驗室檢測，必須分別在獨立的空間進行樣品處理和檢驗。 1. 核酸檢測和基因型鑒定 ⑴Real-time RT-PCR ORF1/ORF2區是諾如病毒基因組中最保守的區域，在同一基因型不同毒株間有相同的保守序列，根據這段保守區域可用于設
realtime/qPCR－常遇到的那些疑問
通常來講，real-time PCR（ qPCR）的反應程序不需要像常規的 PCR 那樣，要變性、退火、延伸 3 步。由于其產物長度在 80～150 bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。 SYBR@Green 等染料法，好在 PCR 擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲
熒光定量PCR應用——腫瘤篇
?? 腫瘤是是機體在各種致癌因素作用下，局部組織細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，從而導致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學界將其分為良性和惡性兩大類。腫瘤作為全球疾病致死的重要元兇之一，如果發現和治療不及時，有可能導致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發熱及臟器功能受損等，其后果極為嚴重。?
ABI實時定量PCR儀獲批準與美新流感檢驗試劑配套聯用
美國應用生物系統公司(紐約證券交易所代碼：ABI)即日宣布，其新一代7500 Fast Dx Real-Time PCR儀已經獲得美國食品與藥品監督管理局(FDA)的正式批準函件(510(k))，可與美國疾病預防與控制中心的新CDC人類流感病毒實時定量RT- PCR檢測和鑒定組(rRT-PCR Fl
miRNA研究
一、miRNA研究的基本問題和研究方法二、miRNA研究的綜合解決方案1. miRNA微陣列芯片服務Agilent miRNA 芯片（21.0）?Affymetrix miRNA 4.0 芯片2. miRNA測序服務??miRNA-seq文庫構建流程??miRNA測序數據分析流程3. miRNA R
PCR－Array－技術原理
?PCR Arrays是分析一組特定基因表達的可靠工具，引物經過優化。每個96孔板、384孔板PCR Array都包含SYBR? Green優化的引物分析，可對相關的通路或疾病相關的基因進行細致的研究，并含有相應的RNA、DNA質量控制。PCR Arrays也可針對您特定的研究興趣對一些基因作定制化